应激过程中多个器官氧化和抗氧化变化的实验研究

一、应激时几个脏器中氧化和抗氧化作用变化的实验研究（论文文献综述）

潘烨灿^[1]（2021）在《大蒜素对肿瘤细胞的氧化还原影响研究》文中提出近年国内外的流行病学调查和实验研究均表明,大蒜素具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等生理功能,且这些功能大多与大蒜素调控机体氧化还原水平的活性相关。阐释肿瘤细胞中的氧化还原水平及肿瘤细胞中高表达的APE1（AP endonucleases-1,Ref-1,脱嘌呤嘧啶核酸内切酶）进行时空表达的研究未曾报道。因此,本文对大蒜中特征营养物质影响肿瘤细胞氧化还原水平失衡等开展研究,构建了DNA纳米框架结构,并阐释了肿瘤细胞中ROS（Reactive Oxygen Species,总活性氧）及APE1的含量、分布等,从而发掘出了大蒜素对典型肿瘤细胞氧化还原的影响及作用机制,为大蒜中特征营养物质的功效研究提供了理论基础。本文建立了PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate,佛波酯）氧化应激模型,并以ROS作为单一评价指标,构建了二因素中心能响应面模型,并对最佳的调控孵育条件做出了推测,认为10mg/L大蒜素提前孵育24 h时可以保护细胞免受PMA氧化应激带来的ROS含量升高的影响。对不同大蒜素孵育组别的GSH-Px（Glutathione Peroxidase,谷胱甘肽过氧化物酶）等5种氧化还原生物标志物酶体系进行表达测定,并利用该组指标计算权重因子组成系统的综合评价体系,从而解决了生物体系中复杂的抗氧化能力评估难题。在受试组中10 mg/L大蒜素提前孵育24 h后经PMA干扰的细胞组得到了最高的得分,这与响应面模型模拟到的结果一致。通过测定各组别中的氧化损伤产物MDA（Malondialdehyde,丙二醛）、8-oxo-d G的表达含量,推测出经过10 mg/L大蒜素提前孵育24 h后的大蒜素,可以保护Hela细胞免受脂质过氧化损伤和DNA过氧化损伤。这两者不良影响的结果与综合评分结果成反向相关,推测出大蒜素调控机体氧化还原水平,可能与机体中的基因损伤修复途径相关,这为后续研究大蒜素保护细胞免受PMA氧化损伤的相关机制机理科学问题提供了方向。为了更加可视化地阐述大蒜素对肿瘤细胞中的ROS和APE1酶（调控基因损伤及氧化还原水平）的表达影响,本研究基于DNA分子模拟的数据,开发了一种可以同时检测细胞中多种物质的DNA框架探针。经实验表征,所建的DNA四面体框架被认为是一种多功能的3D立体结构,可以通过PCR梯度退火组装而成,该结构具有结构可控性、细胞相容性、高度稳定性、低毒性,并能以荧光强度的方式特异性地呈现细胞中ROS、APE1酶等物质的时空共定位。经实验证明,DNA纳米框架手段可视化地对多种物质之间的时间-空间变化以及与线粒体之间的关系进行了分析,得出了ROS和APE1酶的表达不仅在剂量上存在协同关系,在空间上也存在着一定的协同递增递减的变化关系。与此同时,验证了大蒜素可以调控细胞中的ROS含量、APE1酶表达这一上述结论,更为创新的是提出了ROS、APE1在时空上的共定位这一概念,由此我们推测大蒜素通过调控肿瘤细胞中的ROS含量从而影响APE1酶的表达,进而对肿瘤细胞的基因修复能力有所改变,最终形成细胞中的氧化还原与基因氧化损伤的保护机制。

杨君君^[2]（2021）在《天然食材来源的抗氧化剂参与调控骨性关节炎氧化应激的相关研究》文中认为研究背景骨性关节炎（osteoarthritis,OA）与基因、代谢紊乱、饮食作息、肥胖、长期体力劳动及既往关节损伤等多因素相关,发病机理不明从而使其治疗受限。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）可选用关节腔输注手段,进入OA关节腔内,发挥其多向分化优势及旁分泌功能,但易受到局部组织微环境的干扰导致其治疗作用下降。越来越多的基础研究表明:氧化应激参与了OA发病的病理生理过程;长期摄入抗氧化剂丰富的食材（大蒜、西兰花及番茄等）有利于延缓OA的进程;MSCs关节腔注射治疗OA效果不佳可能与关节腔内过多的活性氧导致MSCs存活受限有密切联系。因此,本研究选取了来源于这些天然食材的具有抗氧化功能的生物活性物质（大蒜素、萝卜硫素及番茄红素）,并选用目前研究较为广泛的抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）作为经典对照,来探索这一系列抗氧化剂对OA的调控治疗效果、对MSCs关节腔注射治疗OA的影响及其可能相关的机制。研究目的本研究通过选取大鼠脂肪干细胞系、提取人或大鼠OA软骨细胞及建立大鼠OA模型,探讨大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人或大鼠OA软骨细胞表型影响、大鼠OA的治疗效果、大鼠脂肪干细胞表型变化及MSCs关节腔注射疗法治疗大鼠OA的疗效的作用与分子机制。研究方法第一部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA骨软骨组织及软骨细胞表型影响1.人OA软骨细胞的分离提取与培养提取、培养并扩增人OA软骨细胞,选用P1代人OA软骨细胞作为实验细胞,显微镜下进行拍照观察,HE、阿尔新蓝、Safranine O及COL 2荧光染色鉴定;2.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA软骨细胞活性的影响采用CCK-8法检测不同梯度浓度大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸对人OA软骨细胞活性的影响,并初步确定后续实验所用的药物浓度。根据CCK-8法初步筛选浓度后,于光学显微镜下检测细胞状态有无改变,并再次用Calcein-AM/PI双染检测药物处理人OA软骨细胞后细胞的存活状态;3.采用H2O2诱导体外实验中的氧化应激状态选取200μM H2O2（用培养基进行梯度稀释）对骨软骨组织和软骨细胞进行诱导,诱导8 h,即完成体外氧化应激状态的诱导;4.人骨软骨组织的获取及其处理用电钻将人骨软骨组织从全膝关节置换术的关节样本中分离并加入含有H2O2的培养基中完成氧化应激诱导,吸除原培养基后再加入含抗氧化剂的培养基中进行处理。处理完成后,固定脱钙包埋,石蜡切片,采用HE、番红O及甲苯胺蓝染色检测骨软骨组织的形态及其细胞外基质的表达;5.人OA软骨细胞的处理在人OA软骨细胞中加入含有H2O2的培养基完成氧化应激的诱导,吸除诱导培养基后再加入含抗氧化剂的培养基中处理。完成处理后,准备进行以下检测:CCK-8、光学显微镜、HE染色及流式细胞仪:检测细胞形态及凋亡比例;阿尔新蓝及Safranine O染色:检测ACAN表达;免疫荧光、Western-Blot及qPCR:COL X、iNOS、COL 2、ACAN、SOX-9、COL1、i NOS、IL-6、TNF-α、MMP-13及Nrf2的表达;ELISA检测上清IL-6、TNF-α及MMP-13含量;qPCR检测细胞中GPX1、NOX-4、GPX3、GPX4、IL-1β、SOD1、CAT、GST、ADAMTS-5及COX-2的表达;6.抗氧化剂调控人OA软骨细胞的通路研究采用全反式维甲酸抑制细胞中Nrf2的表达,在抗氧化剂添加或不添加Nrf2抑制剂的情况下按照上述方法同样处理人OA软骨细胞。Western-Blot检测细胞Keap1、p-Nrf2、Nrf2、COL 2、SOX-9、i NOS及IL-6的含量;第二部分:膝关节腔注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠OA的治疗效果1.大鼠软骨细胞的分离提取与培养提取分离大鼠软骨细胞并选用P1代大鼠软骨细胞作为本部分实验所需细胞,显微镜下进行拍照观察;2.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠软骨细胞的活性影响CCK-8法检测在第一部分使用的抗氧化剂的浓度对大鼠软骨细胞有无生物学毒性及副作用,估算后续关节腔注射实验所用的药物浓度;3.大鼠膝OA造模及大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸的膝关节腔注射采用前交叉韧带切除术（ACLT）对大鼠膝关节进行OA造模（手术4周后完成造模）。造模完成后,于大鼠关节腔内注射抗氧化剂（1次/周;5周）;4.大鼠膝关节组织学切片染色完成注射后,获取大鼠膝关节样本,固定脱钙包埋,石蜡切片。HE染色检测软骨形态及其周围基质情况;Safranine O-Fast green与COL 2染色检测关节软骨中蛋白多糖及COL 2;第三部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞表型的影响1.大鼠脂肪干细胞的培养购买大鼠脂肪干细胞系,体外培养并扩增,选用P7代脂肪干细胞作为实验细胞;2.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞活性的影响采用CCK-8法检测不同梯度浓度大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸对大鼠脂肪干细胞活性的影响,并初步估计后续实验所用的药物浓度;3.采用H2O2诱导体外实验中的氧化应激状态选取200μM H2O2进行诱导8 h,即完成氧化应激状态的诱导;4.大鼠脂肪干细胞的处理在大鼠脂肪干细胞中加入含有H2O2的培养基完成氧化应激的诱导,吸除诱导培养基后再加入含抗氧化剂的培养基处理。完成处理后,检测细胞中i NOS、p53、C-caspase3、SOX-9、COL 2、ACAN、RUNX2、IL-6、TNF-α及MMP-13蛋白的表达;上清中IL-6、TNF-α及MMP-13的含量;大鼠脂肪干细胞增殖、迁移与分化能力的变化;大鼠脂肪干细胞活性氧的含量变化;第四部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞在关节腔内生存情况及其对大鼠OA的治疗效果的研究1.大鼠ADSCs的标记采用近红外光染料Di R对大鼠脂肪干细胞进行标记;2.大鼠OA造模及抗氧化剂与抗氧化剂+ADSCs膝关节腔注射采用ACLT对大鼠膝关节进行OA造模（手术4周后完成造模）。造模完成后,于大鼠关节腔内注射抗氧化剂+Di R标记的大鼠脂肪干细胞。对于ADSCs存活实验,完成第一次注射后,注射后第3天用活体成像仪器检测大鼠脂肪干细胞在关节腔内存活情况;对于治疗效果实验,1次/周,持续5周,完成注射治疗后进行取材;3.大鼠膝关节组织学切片染色完成注射后,获取大鼠膝关节样本,固定脱钙包埋,石蜡切片。HE染色检测软骨形态及其周围基质情况;Safranine O-Fast green与COL 2染色检测关节软骨中蛋白多糖及COL 2;研究结果第一部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对人OA骨软骨组织及软骨细胞表型影响1.提取人OA软骨细胞生长状态良好,呈典型的铺路石样。阿尔新蓝、番红O染色及COL 2免疫荧光染色提示提取的细胞表达较多的蛋白多糖与COL 2;2.CCK-8结果提示:大蒜素在31μM、萝卜硫素在7μM、番茄红素在1.2μM及N-乙酰-L-半胱氨酸在31μM对人OA软骨细胞活性无明显影响。光学显微镜下形态及Calcein-AM/PI染色进一步证实,抗氧化剂对人OA软骨细胞活性无明显影响;3.HE、番红O及阿尔新蓝染色结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人骨软骨组织的表面不规则,蛋白多糖降解较多;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,骨软骨组织的形态相对完整,蛋白多糖表达稍多;4.相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞核浓缩,细胞间连接与细胞外基质含量明显减少;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞核形态稍恢复,细胞间连接和细胞外基质表达相对增多。流式细胞检测计数提示:相比正常组（0.76±0.09%）,H2O2处理后,人OA软骨细胞凋亡比例明显升高（12.48±0.55%）;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的凋亡比例降低（大蒜素:0.94±0.22%）（萝卜硫素:1.46±0.15%）（番茄红素:1.21±0.16%）（N-乙酰-L-半胱氨酸:1.04±0.14%）。CCK-8提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞活性明显下降;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞活性稍增加。5.免疫荧光染色及Western-Blot结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的i NOS表达含量明显升高;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的i NOS表达含量减少;6.qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的抗氧化酶（GPX1、GPX3、GPX4、SOD1、CAT及GST）与Nrf2的表达含量明显下降,NOX-4的表达明显上升;相比H2O2组,人OA软骨细胞的绝大多数抗氧化酶与Nrf2的表达含量明显上升,NOX-4的表达明显下降;（相比H2O2组,GPX1在大蒜素组、GPX1与GST在萝卜硫素组、GPX3在番茄红素组及GPX1与SOD1在N-乙酰-L-半胱氨酸无明显变化）7.阿尔新蓝、番红O与软骨标志物免疫荧光染色、Western-Blot及qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的COL 2、SOX-9及ACAN表达含量明显下降;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的COL 2、SOX-9及ACAN表达含量明显上升;8.免疫荧光染色、ELISA、Western-Blot及qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显上升;相比H2O2组,加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显下降;9.qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞IL-1β、ADAMTS-5与COX-2表达含量明显上升;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的IL-1β、ADAMTS-5与COX-2表达含量明显下降;10.免疫荧光染色、Western-Blot及qPCR结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞COL X表达含量明显上升,COL 1表达无明显变化;相比H2O2组,加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞COL X表达含量明显下降,COL 1表达无明显变化;11.荧光染色及Western-Blot提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞的Keap1、Nrf2及p-Nrf2的表达含量无明显变化;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,人OA软骨细胞的Keap1表达含量明显下降,Nrf2及p-Nrf2表达含量明显上升;12.通路实验中,Western-Blot结果提示:相比正常组,H2O2处理后,人OA软骨细胞Keap1与Nrf2表达无明显变化,SOX-9与COL2表达下降,IL-6与i NOS表达上升;相比H2O2组,加入抗氧化剂及Nrf2抑制剂后,人OA软骨细胞Keap1表达稍下降,Nrf2及p-Nrf2表达含量下降,SOX-9、COL2、IL-6与i NOS表达无明显变化;第二部分:膝关节腔注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠OA的缓解效果1.提取的大鼠软骨细胞生长状态良好,呈典型的多边型铺样,形态均一;2.CCK-8结果提示:大蒜素在31μM、萝卜硫素在7μM、番茄红素在1.2μM及N-乙酰-L-半胱氨酸在31μM对大鼠OA软骨细胞活性无明显影响;3.HE、Safranine O-Fast green及COL 2免疫组化染色结果提示:相比正常大鼠,ACLT造模的OA大鼠软骨表面不光滑,蛋白多糖与COL 2表达较少;相比OA大鼠,关节腔内抗氧化剂注射后的软骨表面稍平整,蛋白多糖与COL 2相对增多;第三部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞表型的影响1.购买的大鼠脂肪干细胞系生长状态良好,呈典型的漩涡样生长,呈长梭状;2.CCK-8结果提示:大蒜素在31μM、萝卜硫素在7μM、番茄红素在1.2μM及N-乙酰-L-半胱氨酸在31μM对大鼠脂肪干细胞活性无明显影响;3.免疫荧光染色及Western-Blot结果提示:相比正常组,H2O2处理后,大鼠脂肪干细胞的i NOS、p53、C-caspase3、IL-6、TNF-α、MMP-13、RUNX2表达含量上升,ACAN、SOX-9与COL 2表达下降;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,大鼠脂肪干细胞的i NOS、p53、C-caspase3、IL-6、TNF-α、MMP-13、RUNX2表达含量下降,ACAN、SOX-9与COL 2表达上升;4.ELISA结果提示:相比正常组,H2O2处理后,大鼠脂肪干细胞的IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显上升;相比H2O2组,在加入抗氧化剂后,大鼠脂肪干细胞的IL-6、TNF-α及MMP-13表达含量明显下降;5.H2O2组大鼠脂肪干细胞的成骨与成软骨分化能力减弱,成脂分化能力增强,大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸组中的“矿化的钙结节”与蛋白多糖增多,而脂肪空泡减少;H2O2组大鼠脂肪干细胞的增殖与迁移能力减弱,大蒜素、萝卜硫素、番茄红素及N-乙酰-L-半胱氨酸组中迁移与增殖的细胞数量较多;第四部分:大蒜素、萝卜硫素及番茄红素对大鼠脂肪干细胞在关节腔内生存及其作为干细胞的混悬液对大鼠OA的治疗效果的研究1.Di R标记后的大鼠脂肪干细胞生长状态活跃,显微镜下细胞膜标记良好;2.活体成像结果提示:相比未协同注射抗氧化剂OA大鼠,在协同注射抗氧化剂后,Di R标记后的大鼠脂肪干细胞在OA大鼠关节腔内存活数量明显增多;3.大鼠膝关节石蜡切片HE、番红-固绿及COL 2免疫组化染色结果提示:相比正常大鼠,OA大鼠与未协同注射抗氧化剂OA大鼠软骨表面不光滑,蛋白多糖与COL 2表达较少;相比未协同注射抗氧化剂OA大鼠,在协同注射抗氧化剂后,大鼠软骨表面稍平整,蛋白多糖与COL 2表达相对增多;研究结论1.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素通过激活Keap1/Nrf2通路降低H2O2诱导后的人OA软骨细胞的氧化应激水平、提高抗氧化酶的表达、抑制炎症因子的表达、改善软骨相关表型及缓解软骨细胞肥大化的影响;2.关节腔内注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素可有效缓解大鼠OA的进展;3.大蒜素、萝卜硫素及番茄红素降低H2O2诱导后的大鼠脂肪干细胞的氧化应激水平、抑制炎症因子的表达、改善成软骨分化及缓解干细胞凋亡衰老与肥大化的影响;4.关节腔内注射大蒜素、萝卜硫素及番茄红素可保护大鼠脂肪干细胞在OA大鼠关节腔内的存活,并可能有助于干细胞的注射治疗OA的效果;

李丽^[3]（2021）在《基于“TLRs信号通路”观察不同配穴对预防应激性胃溃疡“调衡防控”的分子机制研究》文中研究说明目的:本文通过对预针刺不同配穴（合募配穴和俞募配穴）,研究其对应激性胃溃疡（SGU）大鼠胃黏膜形态的影响和对血清及胃组织中氧化-抗氧化与炎症相关因子的影响,以及对胃组织TLRs信号通路及大肠组织TLRs信号通路相关m RNA的影响,从多角度分析不同配穴对应激性胃溃疡大鼠黏膜组织的保护作用。探讨预针刺不同配穴对保护黏膜组织作用上的效应差异,以期对腧穴配伍理论提供实验依据。方法:1.将36只雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组,模型组,合募配穴组和俞募配穴组,每组9只,合募配穴组予以电针“中脘”—“足三里”,10 min/次,隔日1次,俞募配穴组予以电针“中脘”—“胃俞”,10 min/次,隔日1次,两组均干预10天。随后采用水浸束缚应激法建立SGU大鼠模型。采用肉眼及苏木精-伊红染色观察各组大鼠的胃黏膜形态、计算溃疡指数（UI）和病变积分。以观察不同配穴对胃黏膜组织的保护作用。2.采用TBA法测定血清中SOD、MDA水平,比色法测定血清及胃组织MPO、血清GSH-Px水平,硝酸还原酶法测定血清及胃组织NO水平,采用ELISA法测定血清中ET-1、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。以检测血清及胃组织中氧化-抗氧化及炎症因子的水平。3.采用免疫组化染色法观察胃组织TLR4、MyD88、TRIF蛋白表达情况。采用Western blot法检测胃组织中TLR4、MyD88、IκB-α蛋白的表达。以观察不同配穴对TLR4信号通路的调节作用。4.采用Fast QC测序数据,对原始数据质量评估;采用Trim galore测序数据并进行质量控制;采用HISAT2参考基因组比对;采用Rseqc对转录组整体质量评估;采用String Tie进行基因表达定量;采用deseq2进行差异基因鉴定;采用WGCNA进行WGCNA分析;采用Cluster Profiler进行富集分析（GO富集分析、KEGG富集分析）,以检测大鼠大肠组织TLRs信号通路相关m RNA表达情况。结果:1.通过观察胃组织肉眼及胃溃疡组织形态学的变化,同时结合UI及病变积分,发现预针刺合募配穴与俞募配穴均具有保护SGU大鼠胃黏膜的作用,与模型组相比UI及病变积分,具有显着性差异（P<0.0001）,合募配穴组与俞募配穴比较UI上无显着性差异（P>0.05）,从病变积分上来看,合募配穴组的效果优于俞募配穴组（P<0.05）。说明从病理组织切片中观察合募配穴对胃黏膜的保护作用优于俞募配穴组。2.预针刺合募配穴组与俞募配穴组能有效预防当SGU发生时氧化-抗氧化因子紊乱状态,胃组织中,模型组与空白组比较MPO（P<0.001）,NO（P<0.05）水平显着上升,俞募配穴组与模型组比较MPO显着下降（P<0.001）,合募配穴组与模型组比较下降不显着（P>0.05）,说明俞募配穴具有降低MPO水平的作用。合募配穴组与模型组比较NO显着下降（P<0.05）,俞募配穴组与模型组比较,NO上升但不显着（P>0.05）。说明胃组织中合募配穴可显着降低NO的水平。3.模型组与空白组比较,血清中SOD（P<0.0001）,NO（P<0.001）,GSH-Px（P<0.001）水平显着下降,MPO（P<0.0001）、MDA（P<0.0001）、ET-1（P<0.001）水平显着上升,俞募配穴组、合募配穴组与模型组比较,血清中MPO（P<0.05）,MDA（P<0.001）,ET-1（P<0.001）水平显着下降,说明合募配穴组与俞募配穴组在调节血清MPO、MDA、ET-1水平上具有共同点。合募配穴组与模型组比较SOD（P<0.0001）,NO（P<0.001）,GSH-Px（P<0.0001）水平显着上升。俞募配穴组与模型组比较SOD（P<0.05）,NO（P<0.001）水平显着上升。合募配穴与俞募配穴组比较SOD（P<0.05）,GSH-Px（P<0.001）水平显着上升。说明合募配穴组与俞募配穴组比较不同点在于SOD、GSH-Px水平上。4.模型组与空白组相比,IL-6（P<0.0001）,TNF-α（P<0.0001）,IL-1β（P<0.001）含量显着升高,合募配穴组与模型组比较,预针刺处理大鼠后IL-6和TNF-α含量显着减少（P<0.0001）,但IL-1β含量之间并没有显着性差异（P>0.05）,俞募配穴组与模型组比较,预针刺处理大鼠后IL-6和TNF-α含量显着减少（P<0.0001）,IL-1β（P<0.001）含量亦显着下降,说明俞募配穴组与合募配穴组比较不同点在于调节IL-1β含量上。5.与空白组相比,模型组显着提高了TLR4和MyD88,TRIF的表达（P<0.05）,降低IκB-α的表达（P<0.05）,合募配穴组与俞募配穴组预处理显着降低了TLR4、MyD88和TRIF的表达（P<0.05）,提高了IκB-α的表达（P<0.05）,这表明预针刺合募配穴与俞募配穴可抑制TLR4/MyD88/TRIF/IκB信号通路的激活而发挥保护胃黏膜组织的作用。其不同点在于MyD88蛋白表达量上。6.在KEGG富集中,富集到的TLR信号通路是Toll-like receptor signaling pathway。空白组与模型组比较应激性胃溃疡发生时改变的关键相关基因有Casp8,Nfkbia,Tlr4,Ctsk,Cxcl10,Spp1,Cxcl11,Irf7,Traf6;在GO富集中,合募配穴组与俞募配穴组保护黏膜组织的基因共同的有1个,为Cd36,俞募配穴与合募配穴预防黏膜组织的不同的关键基因有Tlr1,S100a9,Reg3g,Lbp,Tnf,Tlr5,Nod2。结论:1预针刺对SGU大鼠的氧化应激及炎症因子水平有调整作用,这可能是“调衡防控”的重要起始步骤之一。其中,不同配穴效应差异的关键因子可能是SOD、GSH-Px、MPO、IL-1β。2预针刺对SGU大鼠黏膜组织的保护作用可能是通过TLRs信号通路转导实现的。这可能是“调衡防控”的中心环节之一。合募配穴可能通过抑制TLR1/TLR4/MyD88/TRIF/IκB-α通路而发挥作用,俞募配穴可能通过抑制TLR4/TLR5/MyD88/TRIF/IκB-α通路而发挥作用,其不同点可能在于TLR1、TLR5、MyD88蛋白上。

刘超^[4]（2021）在《雾化吸入活性氧清除性纳米粒靶向治疗心力衰竭的研究》文中指出心力衰竭是一个严重的临床和公共卫生问题,随着时间的推移,发病率和死亡率显着增加。心衰的特征是交感神经系统和RAAS激活,同时伴有心肌中ROS水平的增加。鉴于氧化应激在心力衰竭中的重要性,清除过量的活性氧来减轻心肌损伤在理论上是可行的,然而,目前大多数的抗氧化治疗措施未能达到预期的效果,这可能与药物在心脏的滞留时间和累积量不足,在其它脏器的非特异性分布较多以及药物的抗氧化能力不足等原因有关。因此,探索新的治疗方法或药物递送方式,以更好的靶向到心肌组织,从而实现减轻心肌损伤的目的。考虑到吸入给药操作简便、依从性好、全身不良反应相对较少等优点,我们构建了一种以抗氧化纳米药物（TPCD NP）为基础的无创雾化吸入递送系统,纳米药物可以通过肺循环到达心肌。另外,为了实现更好的靶向效果,我们通过在TPCD NP的外围修饰上线粒体靶向基团,以显着提高其心肌靶向效率;并通过包载抗炎多肽Ac2-26,进一步提高治疗效果。方法1.基于β-CD的活性氧清除材料的合成与表征将Tempol（Tpl）和4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）结合到β-CD上,合成了一种抗氧化材料TPCD。通过1H NMR和FT-IR对TPCD进行表征。2.溴代十八烷基三苯基膦（STPP）的合成与表征将溴代十八烷与三苯基膦溶于乙腈中,用正己烷和乙醚洗涤,干燥得到STPP。所得材料用1H NMR表征。3.活性氧清除性纳米粒TPCD NP的制备将卵磷脂和DSPE-m PEG2000溶解于乙醇,然后加入去离子水中。将溶解在甲醇中的TPCD加入到上述水相中搅拌。除去机溶剂和多余的水后得到TPCD NP。4.活性氧清除性线粒体靶向纳米粒TTPCD NP的制备将卵磷脂、STPP和DSPE-m PEG2000分散在去离子水中。然后将溶解在有机溶剂中的TPCD加入到上述液体中搅拌。除去有机溶剂和多余的水后得到TTPCD NP。5.活性氧清除性载药纳米粒ATPCD NP和活性氧清除性线粒体靶向载药纳米粒ATTPCD NP的制备将卵磷脂、DSPE-m PEG2000或卵磷脂、DSPE-m PEG2000与STPP溶解于乙醇,然后加入去离子水中。TPCD溶于甲醇,加入溶于DMSO的Ac2-26,将得到的溶液加入到上述水相中搅拌。除去有机溶剂和多余的水,得到ATPCD NP或ATTPCD NP。6.纳米粒的表征分别采用透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）和马尔文激光粒度仪对纳米粒的外貌形态、粒径和Zeta电位进行观察和测定。7.TPCD NP体外活性氧清除能力测定采用H2O2试剂盒和超氧阴离子检测试剂盒检测TPCD NP清除H2O2和超氧阴离子的能力。利用DPPH·来评价TPCD NP清除自由基的能力。8.TPCD NP细胞吞噬实验H9C2细胞与终浓度为50μg/m L Cy5/TPCD NP（Cy5标记的TPCD NP）孵育不同时间后,用共聚焦显微镜（CLSM）检测H9C2细胞对Cy5/TPCD NP的时间依赖性吞噬。同样,与不同剂量Cy5/TPCD NP孵育2 h后,研究细胞对纳米粒的浓度依赖性吞噬。在TTPCD NP吞噬实验中,线粒体用Mito-tracker Green FM染色,CLSM检测H9C2细胞对TPCD NP或TTPCD NP吞噬和线粒体共定位。将A549细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、小鼠巨噬细胞RAW264.7和H9C2细胞培养在12孔板中。H9C2细胞加或不加阿霉素（DOX）,A549细胞、HUVECs和RAW264.7细胞不加DOX。细胞与Cy5/TPCD NP孵育不同时间后,收集细胞通过FACS定量分析细胞对纳米粒的吞噬。同样,与不同剂量Cy5/TPCD NP孵育2 h后,检测细胞吞噬情况。为了比较H9C2细胞对TPCD NP或TTPCD NP的吞噬情况。H9C2细胞加入DOX后。收集细胞进行FACS分析。9.TPCD NP对H9C2细胞内活性氧（ROS）生成的影响先用不同剂量的TPCD NP干预H9C2细胞,再用DOX处理细胞。然后用DCFH-DA染色。采用CLSM检测细胞内ROS水平。在FACS检测细胞内ROS生成的实验中,按照类似的方法,收集细胞采用FACS定量分析细胞内ROS水平。10.丙二醛（MDA）、肌钙蛋白I（c Tn I）、乳酸脱氢酶（LDH）的定量测定先用纳米粒预处理细胞,再用DOX作用于细胞。随后收集细胞培养上清。分别用c Tn I和LDH试剂盒检测c Tn I和LDH水平。同时收集细胞,反复冻融,直到细胞完全裂解。离心后收集上清。用MDA试剂盒检测MDA水平,BCA试剂盒定量总蛋白水平。11.细胞水平初步安全性检测将A549细胞、HUVECs、RAW264.7细胞和H9C2细胞与不同浓度TPCD NP共孵育一定时间。用CCK-8法测定细胞活力。12.TPCD NP经雾化吸入后在体内的分布雄性C57BL/6小鼠暴露在雾化箱中,用Cy7.5/TPCD NP（Cy7.5标记的TPCD NPs）雾化。在不同时间点采集全血及分离心脏等主要脏器。然后采用IVIS小动物活体成像系统进行检测,并计算荧光强度。通过比较气管内给药和雾化吸入给药,采用IVIS进行检测,并计算荧光强度,评估雾化吸入后的剂量,13.TPCD NP经雾化吸入后在肺组织细胞中的分布小鼠雾化吸入Cy5/TPCD NP 24 h后收集肺组织,肺切片分别与Ep CAM、CD31和CD68的抗体孵育。用CLSM检测Cy5/TPCD NP与肺上皮细胞、肺内皮细胞和肺巨噬细胞的共定位情况。另外,雾化吸入Cy5/TPCD NP 60 h后,分离心脏,冰冻切片,用CLSM检测Cy5/TPCD NP在心脏的沉积。Cy5/TPCD NP经雾化吸入24 h后,将肺组织研磨,消化后提取单细胞悬液。然后用CD45R、CD326、CD31、F4/80、CD11b抗体对细胞进行染色,采用FACS定量分析。14.TPCD NP经雾化吸入后在血液白细胞中的分布Cy5/TPCD NP经雾化吸入后12h,采集全血。然后用不同抗体对细胞进行染色,并用FACS进行定量分析。15.TPCD NP对DOX诱导的小鼠心肌损伤疗效评价将10-12周的雄性C57 BL/6小鼠随机分为5组。DOX和DOX+TPCD NP组小鼠均单次腹腔注射DOX（15 mg/kg）。DOX+TPCD NP组小鼠从给予DOX前2 d开始每天雾化吸入TPCD NP（4、10、25 mg/kg）,持续7 d。取心、肝、脾、肺、肾等主要器官。计算器官重量与胫骨长度的比值。采集血样进行血常规和生化分析。为了评价右丙亚胺（DEX）的疗效,在给予DOX前2 h一次性腹腔注射DEX（200mg/kg）。7天后对小鼠实施安乐死。分离心脏和胫骨,计算心脏重量与胫骨长度的比值。为了评价TTPCD NP的疗效,小鼠在给予DOX前2天雾化吸入TPCD NP或TTPCD NP（25 mg/kg）。7天后分离心脏和胫骨,计算心脏重量与胫骨长度的比值。为了评价ATTPCD NP的疗效,小鼠在给予DOX前2天雾化吸入Ac2-26（14.75ug/kg）、TTPCD NP（25 mg/kg）和ATTPCD NP（25 mg/kg）。同样7天后分离心脏和胫骨,计算心脏重量与胫骨长度的比值。16.小鼠心功能检测用异氟醚麻醉小鼠,通过动物超声进行检测、统计。17.血清c Tn I、LDH、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌酸激酶（CK）水平测定试剂盒检测血清c Tn I、LDH、CK-MB和CK的含量。18.氧化应激水平检测心脏冰冻切片与DHE在37℃避光中孵育30 min,荧光显微镜检测。使用Image-pro Plus 6.0软件分析荧光强度。心肌组织经匀浆后离心收集上清。并用ELISA试剂盒测定MDA和H2O2水平。19.病理学分析将心脏固定在4%多聚甲醛中。石蜡包埋切片,用苏木精和伊红（H&E）染色,观察其病理变化。20.TPCD NP的急性毒性评价雾化不同剂量TPCD NP。每天记录体重,7天后采集血液样本进行分析。分离主要脏器称重然后固定。记录肺组织的干重和湿重,计算肺组织的干/湿重比。取肺组织灌洗液,检测TNF-α、IL-1β水平。结果1.TPCD NP的制备与表征通过将Tpl和PBAP结合到β-CD上,合成了一种抗氧化材料TPCD。根据1H NMR谱上的质子信号,TPCD的每个β-CD分子上约有2个Tpl和5个PBAP。采用改进的纳米沉淀法/自组装法制备TPCD NP。TEM和SEM观察发现TPCD NP呈球形。平均粒径为101 nm,zeta电位为-29.4±1.7 m V。TPCD NP能有效清除H2O2和超氧阴离子。此外,TPCD NP对DPPH自由基呈时间依赖性和剂量依赖性清除。2.TPCD NP的体外生物活性研究H9C2细胞、A549细胞、HUVECs和RAW264.7细胞能有效吞噬Cy5/TPCD NP,呈时间和剂量依赖性。此外,结果显示,DOX作用于H9C2细胞对Cy5/TPCD NP的吞噬效率显着高于未加DOX作用的细胞。TPCD NP预处理可剂量依赖性地降低DOX作用后H9C2细胞中ROS的水平,抑制MDA的生成,以及降低c Tn I和LDH的释放。3.雾化吸入后TPCD NP的心肌靶向能力及作用机制研究吸入的Cy7.5/TPCD NP逐渐被吸收并转运到心脏。免疫荧光分析显示,吸入后Cy5/TPCD NP与肺Ep CAM+上皮细胞、CD31+内皮细胞和CD68+巨噬细胞有共定位。FACS检测表明Cy5/TPCD NP的吸收和转运主要由肺上皮细胞和肺内皮细胞介导。通过比较气管内给药和雾化吸入给药肺部荧光强度,约4%的TPCD NP在肺内沉积。4.雾化吸入TPCD NP靶向治疗DOX诱导的心力衰竭TPCD NP可显着增加DOX引起的心脏重量和HW/TL的降低,减轻心功能障碍。同时降低了MDA、H2O2等氧化应激相关标志物以及c Tn I、CK-MB等心脏损伤指标的水平。5.TPCD NP和DEX对DOX诱导的小鼠心力衰竭的疗效TPCD NP和DEX均可增加DOX导致的LVEF和LVFS的降低,改善心脏功能。显着增加DOX导致HW/TL比值降低。降低心肌MDA、H2O2水平及血清c Tn I、CK水平。6.靶向纳米粒的制备表征及体外生物活性研究TTPCD NP呈球形,平均粒径为104 nm,zeta电位为-14.3 m V。Cy5/TTPCD NP能被H9C2细胞有效吞噬。TTPCD NP的靶向性较TPCD NP提高。与这一发现相一致的是,TTPCD NP比TPCD NP更显着的减轻DOX诱导的H9C2细胞氧化应激损伤。7.TTPCD NP的心肌靶向及对心衰模型疗效评价在心脏部位,Cy7.5/TTPCD NP具有相对较强的荧光。与TPCD NP相比,TTPCD NP更有效地抑制了HW/TL比值的降低。同样,TTPCD NP显着减轻心功能障碍,降低了心肌MDA和H2O2含量及血清c Tn I和CK水平。8.靶向载药纳米粒的制备、表征及对心衰小鼠模型的的疗效评价采用改进的纳米沉淀法/自组装法将Ac2-26多肽包载到TPCD NP或TTPCD NP中,这种含有Ac2-26的TPCD NP或TTPCD NP平均粒径分别为103.9 nm和109.7 nm。zeta电位分别为-32.9±1.2 m V和13.3±0.2 m V。Ac2-26的载药量为0.59μg/mg。与Ac2-26相比,ATPCD NP和ATTPCD NP更有效的减轻DOX诱导的H9C2细胞的氧化应激损伤。动物实验结果表明,ATPCD NP和ATTPCD NP可更有效的抑制DOX作用后心脏重量的下降、减轻心肌损伤,改善心功能,以ATTPCD NP的效果最佳。9.TPCD NP体内安全性评价经与不同剂量的TPCD NP孵育后,H9C2细胞、A549细胞、HUVECs和RAW264.7巨噬细胞均有较高的细胞活力。吸入高剂量的TPCD NP后,小鼠的体重、脏器指数和肺干/湿重比均无显着变化。肺泡灌洗液中炎性细胞因子TNF-α、IL-β以及血常规和肝肾功没有出现异常改变,HE切片显示气管、肺和其他主要器官未见明显损伤。结论1.本研究通过将Tpl和PBAP结合到β-CD上,成功合成了抗氧化材料TPCD并制备了其纳米粒。体外实验表明,TPCD NP能被H9C2细胞吞噬,通过清除过量活性氧,减轻心肌细胞的氧化应激损伤。2.雾化吸入的TPCD NP在肺部的吸收和转运主要由肺泡上皮细胞和内皮细胞介导,进入肺毛细血管的TPCD NP将进一步经过肺循环和体循环到达心肌。3.雾化吸入的TPCD NP可显着抑制DOX诱导的小鼠心肌功能失调,其疗效明显优于临床使用的药物右丙亚胺。4.通过线粒体靶向基团的修饰,TTPCD NP的心肌靶向能力、细胞吞噬效率较TPCD NP显着增强,治疗效果更加显着。TTPCD NP对DOX诱导的心功能障碍有更显着的改善作用。ATTPCD NP对小鼠的心功能保护作用较TTPCD NP进一步增强。5.初步急毒实验结果显示,雾化吸入高剂量的TPCD NP对小鼠无明显毒性作用。

付国庆^[5]（2021）在《基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究》文中指出邻苯二甲酸（2-乙基己基酯）（DEHP）是一种广泛使用的增塑剂,具有显着的雄性生殖毒性,可引起职业暴露人群血清睾酮和精子活力下降,精子数量减少。然而,全球范围内还没有完善的DEHP职业接触限值和职业危害防护措施。为了推进DEHP职业接触限值的研究,加强DEHP对雄性生殖毒性的防治,促进DEHP职业暴露人群的健康安全,采用动物实验证实了DEHP对雄性生殖毒性的影响,基于DEHP诱导的睾丸组织差异性表达pi RNA和PIWI蛋白预测DEHP诱导雄性生殖毒性的调控通路,探究预测通路在体内动物模型和体外细胞模型中的作用,初步提出了DEHP诱导雄性生殖毒性灵敏的效应指标以及可能的作用机理。筛选出DEHP诱导雄性生殖毒性可能的调控通路,为DEHP暴露灵敏效应标志物的筛选和职业接触限值的研究提供了基础的研究方向。构建DEHP暴露的大鼠模型,分别用pi RNA芯片和Western blot法检测大鼠睾丸组织pi RNA和PIWI蛋白表达水平,结果发现,DEHP暴露组大鼠睾丸中1351个pi RNA表达上调,944个pi RNA表达下调,选择10个经实时荧光定量PCR法检测验证的差异性表达pi RNA,用生物信息学方法进行靶基因预测以及GO和KEGG pathway富集,文献研究法探讨差异性表达的PIWI亚家族Piwil2蛋白的调控通路,综合分析差异性表达pi RNA和Piwil2调控通路,经筛选和初步验证Piwil2/STAT3/p53、Piwil2/PI3K/Akt、INSR/IRS1/PI3K/Akt/Fox O1和AMPK/Fox O1通路可能参与DEHP诱导的雄性生殖毒性调控。研究了经筛选的通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用。用250、500、1000 mg/kg DEHP的剂量连续染毒雄性大鼠28天,检测血清睾酮水平、附睾精子浓度、睾丸组织结构改变、睾丸组织凋亡和自噬水平评价雄性生殖毒性,检测睾丸组织中筛选通路相关蛋白表达水平,以了解它们在DEHP诱导雄性生殖毒性中的作用。结果发现,血清睾酮在所有DEHP暴露组均下降,是DEHP暴露的敏感指标。250 mg/kg·day暴露组DEHP诱导细胞自噬避免细胞凋亡,在500和1000 mg/kg·day暴露组,自噬水平下降,DEHP激活线粒体凋亡通路,导致睾丸细胞凋亡增加,睾丸组织损伤,可能与STAT3/p53通路有关。INSR、IRS1、Piwil2和STAT3是DEHP暴露灵敏且稳定的指标,其表达水平在所有暴露组均显着降低,可以作为DEHP早期暴露生物效应标志物进行进一步研究。探讨了piRNA/PIWI调控的不同通路在DEHP代谢产物MEHP诱导小鼠初级精母细胞（GC-2spd）毒性中的作用。用0、1、10、100μM MEHP和100μM NAC+100μM MEHP分别处理GC-2spd细胞,检测MEHP处理组和抗氧化剂NAC预处理组细胞氧化应激水平、凋亡和自噬水平以及pi RNA/PIWI调控通路相关蛋白表达水平。结果显示,在10、100μM MEHP暴露组,MEHP通过氧化应激介导STAT3/p53通路调控线粒体凋亡通路导致GC-2spd细胞凋亡,MEHP还通过氧化应激影响PI3K/Akt/m TOR和AMPK/m TOR通路促进GC-2spd细胞自噬。DEHP雄性生殖毒性现有的敏感效应指标为睾酮,INSR、IRS1、Piwil2和STAT3可以作为新的效应指标进行进一步的筛选,DEHP通过氧化应激调节STAT3/p53和PI3K/Akt/m TOR影响雄性生殖毒性,为DEHP雄性生殖毒性的防治提供可能的作用靶点,研究结果为DEHP职业接触限值研究提供基础资料,对促进DEHP职业健康安全具有重要意义。

王建武^[6]（2021）在《小分子IR-61改善STZ诱导的糖尿病大鼠排尿功能的实验研究》文中研究指明背景:糖尿病膀胱功能障碍（diabetic bladder dysfunction,DBD）是糖尿病最常见的泌尿系统并发症。据估计,DBD在糖尿病患者中的患病率在43-87%之间,虽然DBD不会危及患者的生命,但它对患者的生活质量造成了极大的困扰。然而到目前为止,对于那些控制血糖和行为疗法无效的患者,尤其是发生逼尿肌收缩无力的DBD晚期患者,临床上仍缺乏有效的治疗手段。因此,开发一种新的DBD治疗手段仍具有十分重要的临床意义。课题组在之前的研究中合成了一种新型七甲川花菁荧光小分子化合物—IR-61。研究发现IR-61具有良好的生物相容性,可优先蓄积于细胞的线粒体中,并可减轻氧化应激引起的细胞损伤。考虑到DBD的发生发展与高血糖引起的氧化应激损伤密不可分,我们假设具有潜在抗氧化作用的IR-61可以通过调节糖尿病环境中膀胱组织和细胞的氧化应激水平,减轻膀胱组织和细胞的氧化应激损伤,从而对糖尿病环境下的膀胱功能起到一定的保护作用。在本实验中,我们研究了IR-61对链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠膀胱功能、组织、细胞的影响,探讨了其能否预防或减缓DBD的发生发展及其可能的作用机制。材料与方法:用STZ诱导建立雌性糖尿病大鼠模型后,通过腹腔分别注射IR-61溶液或空白溶剂,分为对照组、糖尿病组和IR-61治疗组。首先我们通过近红外荧光成像检测IR-61在糖尿病大鼠重要脏器中的蓄积水平以及通过组织冰冻切片、细胞免疫荧光染色在共聚焦显微镜下明确其组织、亚细胞定位。然后通过充盈性膀胱测压评价IR-61对糖尿病大鼠膀胱功能的改善作用。最后分离各组大鼠的膀胱组织进行近红外荧光成像、组织透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）、组织切片染色以及通过组织蛋白质印迹实验（western blot,WB）检测分析相关蛋白分子的表达情况。结果:离体器官的近红外荧光成像显示IR-61在糖尿病大鼠的膀胱内高度蓄积并主要定位在膀胱的平滑肌层,同时共聚焦实验证明其主要定位于膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle cells,BSMCs）的线粒体上。充盈性膀胱测压实验证明IR-61能够显着改善糖尿病大鼠的排尿功能。组织形态学相关实验结果显示,IR-61有效地减轻了糖尿病大鼠膀胱平滑肌（bladder smooth muscle,BSM）的病理损伤。此外,IR-61有效减少了线粒体凋亡途径相关蛋白（B淋巴细胞瘤-2基因,Bcl-2;BCL2关联X蛋白,BAX;细胞色素C,Cytochrome C;剪切型的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9,cleaved-Caspase-9）的不利表达,显着降低了糖尿病大鼠BSMCs的凋亡水平。同时组织冰冻切片染色和透射电镜结果证明IR-61可显着降低糖尿病大鼠BSM中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平,减轻BSMCs线粒体的损伤。此外,蛋白印迹实验发现IR-61可显着上调糖尿病大鼠BSM中红系衍生的核因子2相关因子2（Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,Nrf2）及其下游相关抗氧化蛋白的表达水平。总而言之,以上结果表明IR-61可能通过Nrf2激活BSMCs的内源性抗氧化系统,抵御高糖环境对线粒体、BSMCs、平滑肌组织的氧化应激损伤,进而保护了糖尿病大鼠的排尿功能。结论:1.IR-61可以高度聚集于糖尿病大鼠的膀胱组织中,并且主要定位在膀胱平滑肌层以及BSMCs的线粒体上。2.IR-61对糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织和排尿功能具有显着的保护作用,而对糖尿病大鼠的体重和血糖水平并没有明显的改善作用。3.IR-61可能通过激活Nrf2通路保护BSMCs的线粒体免受氧化应激损伤,抑制其发生凋亡,提示了这可能是IR-61预防或减缓糖尿病大鼠DBD发生发展的潜在作用机制。

黄河^[7]（2020）在《急性高山病和高原红细胞增多症的microRNA表达特征及其病理生理学意义研究》文中认为研究背景我国是世界上高原面积最大,常住人口最多的国家,有6000多万人居住在高原地区。随着高原地区社会经济和国防事业的日益发展,现在每年都有超过1000万人从平原进入高原从事旅游、商贸、建设和军事戍守。高原自然环境恶劣,低压低氧可导致急性高山病（又称急性高原反应）（acute mountain sickness,AMS）和高原红细胞增多症（high altitude polycythemia,HAPC）等疾病高发,严重损害身体健康。AMS是指从平原急进至高原（海拔高度2500 m以上）人群,出现由缺氧引起的以剧烈头痛、头晕、恶心等神经症状为典型表现的一种急性高原病。该病的发病率高,据国内外多项研究显示,AMS发病率高达30%-90%。同时,其危害性很大,轻者显着降低急进高原人的作业能力,影响日常工作,重者可以发展成为高致死率的高原脑水肿（high altitude cerebral edema,HACE）,危及生命安全。因此,AMS已经成为威胁急进高原军民身体健康的主要疾病。HAPC是一种以红细胞过度增生为主要特征的常见慢性高原病,在久居3000-4500 m高原人群中,其发病率为1.21%-24.0%。HAPC对人体具有很大危害性,过度增生的红细胞会引起微循环障碍,造成各器官缺氧损伤;损伤严重者,甚至会发生各脏器血栓栓塞,导致猝死。因此,HAPC高发已经成为严重威胁久居高原军民的重大公共卫生问题。目前对于AMS与HAPC治疗,尚无特异性高、副作用低的治疗药物可用,因此疾病的早期预防具有重要意义。然而,目前对于AMS与HAPC发病风险预测也缺乏特异性强、灵敏性高的生物标志物。究其原因,以往对AMS与HAPC的研究主要集中于生理反应差异、生化代谢改变及病理形态异常等方面,而对其分子生物学机制缺乏系统性探究。因此,从新角度深入研究AMS与HAPC的发病相关分子生物学机制,寻找可能防治靶点及高效的预测标志物,对于维护我国高原军民健康、促进高原地区社会经济和国防事业的发展具有重大的现实意义。近年来,有关microRNA对基因表达调控及其在疾病发病机制中的作用受到广泛关注。microRNA是一类广泛存在于真核细胞中,长度为18-24个核苷酸的内源性小分子非编码RNA。该分子在基因表达调控网络中处于节点位置,通过转录或转录后抑制的方式,调控机体超过30%的编码蛋白质基因。低氧可以引起多种microRNA的表达变化,且许多microRNA参与了缺氧代偿性生理调节与缺氧病理生理学过程。现已发现,microRNA表达异常与冠心病、脑卒中、肝肾缺血损伤、急性呼窘迫症等多种缺氧相关疾病的发生密切相关。这些研究为阐明疾病发病机制和寻找有效的防治靶点提供了全新的思路。然而,microRNA在AMS发病机制中起到什么作用?其是否能作为预测AMS发病风险的高效生物标志物?目前尚缺乏研究。同时,microRNA还参与红系细胞的增殖、分化和成熟,并在真性红细胞增多症、继发性红细胞增多症及骨髓增殖性肿瘤等多种血液疾病的发病中起到重要的作用。然而,microRNA是否参与HAPC这种高原特殊环境中的血液系统疾病的发生发展?目前,也缺乏系统的研究。因此,本文围绕“microRNA在AMS和HAPC中的表达特征及其在疾病发病机制中的作用”这一主题,从下述五部分进行研究。第一部分,采用microRNA表达谱芯片对急性高原低氧暴露后AMS患者和不发病者的血浆标本进行检测,以揭示AMS患者的microRNA表达谱特征。并进一步对AMS发病相关microRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析,以探究这些microRNA所调控的分子生物学过程及信号通路,为AMS发病机制研究提供新的思路。第二部分,以AMS患者体内显着上调的miR-181b-5p为研究分子,分别在小鼠高原脑水肿（high altitude cerebral edema,HACE）模型上对miR-181b-5p的变化进行检测（注:HACE是重症AMS发展而来,目前研究认为二者主要在病情的严重程度不同,而发病机制基本相同,再者由于AMS动物疾病模型的缺乏,故本研究选用HACE模型进行研究）;并进一步在细胞模型上对miR-181b-5p进行分子生物学实验,明确其在AMS炎症相关发病机制中所起的作用,为AMS治疗寻找新的靶点。第三部分,在AMS患者和不发病者平原时（急性低氧暴露前）血浆和唾液标本中进行 microRNA 实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测,为AMS发病风险预测寻找高效生物标志物。第四部分,对HAPC患者和同海拔健康对照的血浆标本进行外泌体RNA-seq检测,以揭示HAPC患者的血浆外泌体microRNA表达谱特征。并进一步对HAPC发病相关microRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析,以探究这些microRNA所调控的分子生物学过程及信号通路,为HAPC发病机制的研究提供新思路。第五部分,在HAPC患者及动物模型的红细胞内对miR-144-3p的变化进行检测;并进一步在红系细胞内针对miR-144-3p设计分子生物学实验,以明确miR-144-3p在HAPC红系细胞功能紊乱相关发病机制中的作用,为HAPC治疗寻找新的作用靶点。研究对象和实验方法一、AMS患者的microRNA表达谱检测（1）研究对象为急性暴露于高原环境中的AMS患者（AMS）和不发病者（Non-AMS）。AMS 诊断根据路易斯湖标准（Lake Louis score system,LLS）进行。（2）采集研究对象的人口学资料、生理学指标及血浆标本。（3）使用microRNA表达谱芯片对血浆标本进行检测,并对结果进行生物信息学分析。（4）运用qRT-PCR验证microRNA表达谱芯片筛选出的AMS发病相关microRNA。二、AMS发病相关分子miR-181b-5p的生物学功能研究（1）通过生物信息学分析,预测在AMS患者中上调的microRNA——miR-181b-5p的靶基因,了解其所涉及的信号通路。（2）选用8周龄的雄性C57BL/6小鼠,分成2组:（Ⅰ）正常对照组,在常氧环境中饲养24 h;（Ⅱ）高原脑水肿组,通过低压氧舱（模拟海拔:6000 m）暴露24 h复合尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（剂量:0.5 mg/kg）复制疾病模型。（3）检测对照组和高原脑水肿组小鼠外周血白细胞中miR-181b-5p、IL-1β、IL-6以及TNF-α表达水平。（4）选用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞作为细胞实验对象。将RAW264.7细胞分成2组:（Ⅰ）正常对照组,在21%O2条件下正常培养24 h;（Ⅱ）低氧和LPS复合刺激组,在1%O2和LPS（100 ng/mL）复合刺激条件下培养24小时,以构建细胞炎症模型。（5）使用 miR-181b-5p 模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）、阴性对照（negative control）转染RAW264.7细胞,检测细胞及上清中IL-1β、IL-6以及TNF-α的mRNA表达及蛋白含量变化。（6）采用双荧光素酶报告基因法鉴定“蛋白激酶C-δ（protein kinase C delta,PRKCD）”是否为miR-181b-5p的靶基因。三、平原血浆和唾液microRNA对AMS发病风险预测的研究（1）研究对象为AMS患者（AMS）和不发病者（Non-AMS）。AMS诊断根据LLS诊断标准进行。（2）采集研究对象的人口学资料、生理学指标。（3）采集AMS组和Non-AMS组的血浆及唾液标本。（4）使用qRT-PCR检测AMS组和Non-AMS组平原血浆和唾液中microRNA表达水平。（5）通过生物信息学分析microRNA生物学功能。（6）采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测AMS组和Non-AMS组急性高原暴露后血浆标本中IL-1β、IL-6以及TNF-α含量。四、HAPC患者microRNA表达谱检测（1）研究对象为HAPC患者和同海拔健康对照。HAPC诊断根据第六届国际高原医学和高原生理学学术会议推荐指南执行。（2）采集研究对象的人口学资料、生理学指标、血常规指标及血浆标本。（3）使用RNA-seq技术对血浆外泌体microRNA进行检测,并对结果进行生物信息学分析。（4）使用qRT-PCR验证筛选出的差异表达microRNA。五、HAPC发病相关分子miR-144-3p的生物学功能研究（1）通过生物信息学分析,预测HAPC患者中上调microRNA——miR-144-3p的靶基因,了解其所涉及的信号通路。（2）检测HAPC患者与健康对照红细胞中miR-144-3p表达水平及氧化物（ROS和MDA）和抗氧化物（SOD和GSH）含量。（3）动物实验研究:选6周龄的雄性SD大鼠,分成2组:（Ⅰ）对照组,在常氧条件下饲养28天;（Ⅱ）HAPC组,在低压氧舱（模拟海拔:5800 m）中持续暴露28天,复制HAPC大鼠模型。（4）检测对照组和HAPC组大鼠红细胞中miR-144-3p表达水平及ROS、MDA、SOD、GSH 含量。（5）选用人红系细胞系K562细胞为细胞实验对象。将K562细胞分成2组:（Ⅰ）正常对照组,在21%O2的培养箱中正常培养6h;（Ⅱ）氧化损伤组,使用含10 μM/mL过氧化氢的培养基,在21%O2的培养箱中培养6小时,构建细胞氧化损伤模型。（6）使用 miR-144-3p 模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）、阴性对照（negative control）转染K562细胞,检测细胞中ROS水平、MDA含量,及抗氧化物SOD1、GCLC、GCLM、CAT、GPX1 及 NQO1 mRNA 表达水平。（7）采用双荧光素酶报告基因法鉴定“核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）”是否为 miR-144-3p 的靶基因。主要结果一、AMS患者的microRNA表达谱特征（1）AMS患者和不发病者的microRNA表达谱存在显着差异microRNA芯片检测,共筛选到93个microRNA在AMS患者与不发病者之间显着差异表达,其中56个血浆microRNA在AMS患者中表达显着上调,37个显着下调（全部 p<0.05）。（2）AMS发病相关microRNA主要涉及低氧适应、能量代谢、血管生成及炎症反应相关信号通路调节AMS发病相关microRNA的功能,主要涉及低氧适应（HIF-1通路）、能量代谢（cAMP通路）、血管生成（VEGF通路）及炎症反应（MAPK、NF-κB、Toll样受体、NOD样受体及TNF等通路）等信号调节。（3）microRNA芯片检测结果可重复性强qRT-PCR 检测结果显示,与 Non-AMS 相较,miR-676-3p、miR-181b-5p、miR-193b-5p和miR-3591-3p在AMS患者血浆中的表达水平显着上调,与microRNA芯片结果趋势一致（全部p<0.01）。（4）miR-676-3p、miR-181b-5p 及 miR-3591-3p 可作 AMS 辅助诊断指标ROC 曲线分析显示,miR-676-3p、miR-181b-5p 及 miR-3591-3p 对 AMS 发病的诊断效能分别为 0.713（95%CI=0.588-0.838,p<0.01）、0.735（95%CI=0.614-0.855,p<0.001）和 0.805（95%CI=0.700-0.911,p<0.001）。二、miR-181b-5p是炎症反应的负调节分子（1）miR-181b-5p涉及炎症反应通路的调节miR-181b-5p的靶基因涉及的信号通路主要为炎症反应相关的信号通路,如:MAPK、NF-κB、NOD样受体、Toll样受体等通路。其中,NF-κB通路中重要基因“蛋白激酶C-δ（protein kinase C delta,PRKCD）”被预测为 miR-181b-5p 的靶基因。（2）miR-181b-5p在小鼠高原脑水肿模型中显着上调表达与对照组相较,小鼠高原脑水肿模型的白细胞中miR-181b-5p、IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显着上调（全部p<0.05）。该结果提示miR-181b-5p与炎症反应之间的潜在关系。（3）miR-181b-5p可通过抑制PRKCD减轻巨噬细胞炎症反应外源性在RAW264.7细胞中过表达miR-181b-5p,可以显着下调细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平,并降低细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量（全部p<0.01）。而外源性在RAW264.7细胞中抑制miR-181b-5p表达后,结果与过表达相反（全部p<0.01）。经双荧光素酶报告基因实验鉴定,PRKCD是miR-181b-5p的靶基因（全部p<0.01）。三、平原血浆和唾液microRNA可作为AMS发病风险预测生物学标志物（1）平原血浆microRNA分子可作为AMS发病风险预测生物学标志物三个平原血浆microRNA 分子（miR-1183、miR-15b-5p及miR-23b-5p）构成的生物标志物组合对AMS发病风险的预测效能可以达到0.872（95%CI=0.836-0.903,p<0.001）。（2）调控抗炎症能力储备可能是血浆microRNA组合生物作用基础GO分析结果显示:miR-1183,miR-15b-5p和miR-23b-5p参与调控免疫系统过程、固有免疫反应、MAPK信号通路、MyD88-Toll样受体信号等经典炎症反应通路调节。相关性分析显示,miR-1183、miR-15b-5p和miR-23b-5p与血浆炎症因子（IL-1β,IL-6和TNF-α）含量显着相关（全部p<0.01）。（3）平原唾液miR-134-3p和miR-15b-5p可预测AMS发病风险平原时唾液miR-134-3p和miR-15b-5p组合对AMS发病风险的预测效能可达到0.811（95%CI=0.731-0.876,p<0.001）。（4）miR-134-3p和miR-15b-5p涉及调控炎症反应GO分析结果显示:miR-134-3p和miR-15b-5p可以共同调控MAPK及Toll样受体信号通路等经典炎症反应通路。四、HAPC患者microRNA表达谱特征（1）HAPC患者和健康对照间的microRNA表达谱存在显着差异RNA-seq检测筛选到44个血浆外泌体microRNA在HAPC患者和同海拔健康对照组间存在显着差异,其中3 3个microRNA在HAPC患者中表达显着上调,11个microRNA表达显着下调（全部p<0.05）。（2）HAPC发病相关microRNA主要的分子生物学功能上述HAPC发病相关microRNA分子涉及鞘脂类、细胞内吞、线粒体自噬、Ras、TNF、MAPK及Hedgehog等多个信号通路的调节。（3）RNA-seq检测结果可重复性强qRT-PCR检测结果显示,与同海拔健康对照相比较,miR-144-3p、miR-210-3p,miR-19b-3p及miR-21-3p在HAPC患者血浆外泌体中的表达水平显着上调（全部p<0.01）。该结果与RNA-seq检测结果趋势一致。五、miR-144-3p是抗氧化损伤通路的负向调节分子（1）miR-144-3p可能涉及抗氧化损伤通路的调节miR-144-3p的靶基因显着富集于HGF受体、NRF2-抗氧化损伤、Sonic Hedgehog及MAPK等信号通路。进一步分析发现“核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）”是 miR-144-3p 的预测靶基因。（2）红细胞miR-144-3p表达上调与其抗氧化能力下降及氧化损伤加重密切相关与对照组相较,在HAPC患者及大鼠模型的红细胞中,miR-144-3p表达水平显着上调（全部p<0.05）。进一步相关性分析发现,红细胞中miR-144-3p与氧化指标ROS和MDA显着正相关（全部p<0.05）,与抗氧化指标SOD和GSH显着负相关（全部p<0.05）。（3）miR-144-3p可能通过抑制NRF2削弱红系细胞抗氧化能力外源性在K562细胞中过表达miR-144-3p,可以显着抑制抗氧化物SOD1、CAT、GCLC、GCLM、GPX1和NQO1mRNA表达水平,加重细胞氧化损伤（全部p<0.01）。而在K562细胞中外源性抑制miR-144-3p表达后,结果与过表达相反（全部p<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实,NRF2是miR-144-3p的靶基因（全部p<0.001）。结论（1）AMS患者和不发病者间的microRNA表达存在显着差异;差异microRNA主要涉及低氧适应、血管新生、能量代谢及炎症免疫等信号通路调节;急性低氧后miR-181b-5p表达不足,导致对NF-κB信号通路重要基因PRKCD抑制减弱,继而加剧外周炎症反应及神经炎症损伤,可能参与AMS发病。（2）平原血浆microRNA 分子（miR-1183、miR-15b-5p和miR-23b-5p）构成的生物标志物组合在可作为汉族青年男性人群AMS发病风险预测的新型生物学标志物;平原唾液miR-134-3p和miR-15b-5p组合可作为汉族青年男性人群AMS发病风险预测的无创生物标志物。（3）HAPC患者和同海拔健康人的microRNA表达存在显着差异;差异microRNA涉及鞘脂类、线粒体自噬、Ras、TNF、MAPK及Hedgehog等多条信号通路的调节;miR-144-3p通过抑制抗氧化损伤信号通路重要调节因子NRF2,继而削弱红系细胞抗氧化物能力,导致红系细胞的氧化损伤加重和功能紊乱,可能参与HAPC的发生发展。

闫嘉晴^[8]（2020）在《次血红素六肽生物功能及其对牙周炎治疗的研宄》文中提出牙周炎是一种由菌斑微生物引起的慢性感染性口腔疾病,可导致牙龈上皮组织炎症,引起牙龈及牙周膜胶原纤维溶解破坏以及牙槽骨吸收,造成牙齿松动脱落。牙周炎发病率高、危害大、病因复杂、病理过程反复、治愈困难,在世界范围内均具有较高的患病率,是造成我国成年人牙齿缺失的首要原因。目前牙周机械治疗和药物治疗仍然是治疗牙周炎最有效的手段,但预后仍差强人意。因此了解牙周炎的发病因素,寻找新的治疗方法和治疗手段迫在眉睫。次血红素六肽（Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys,Dh HP-6）是在天然微过氧化物酶（Microperoxidase-11,MP-11）基础上设计出来的一种过氧化物模拟酶。Dh HP-6与天然过氧化物酶相比,具有易于合成、稳定性高、成本低等优势。前期研究表明Dh HP-6很容易进入细胞并具有较强的清除自由基的能力。因此,本文首先探究了Dh HP-6分子在复杂的p H、温度和溶剂范围内的酶学性质,进而研究了其在细胞和动物水平上对牙周炎的治疗效果及其作用机制。主要研究内容和结果如下:1、Dh HP-6的过氧化物酶酶学性质研究利用酶活分析和谱学方法对Dh HP-6的活性和催化机制进行了探讨研究,考察分析了Dh HP-6催化苯酚反应的影响因素。结果表明Dh HP-6在较宽的p H和温度范围内表现出良好的催化性能,并且对多种有机溶剂表现出了很好的耐受性。在苯酚作为底物的模型反应中,Dh HP-6的过氧化物酶活性明显优于MP-11,其最佳酶活性可达到辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,HRP）活性的16倍。Raman光谱和EPR谱揭示了在甲醇的作用下,Dh HP-6组氨酸上的咪唑基对铁卟啉中心铁进行了轴向配位,使其由高自旋态向低自旋态转变,这有利于催化H2O2产生高活性的氧自由基,从而促进苯酚的氧化反应。正是Dh HP-6在宽泛条件下具有良好的过氧化物酶活性,使其有可能应用于与氧化应激相关性疾病如牙周炎、阿尔兹海默症、糖尿病等的治疗。2、Dh HP-6对人牙龈成纤维（Human gingival fibroblasts,HGFs）细胞抗氧化损伤作用的研究建立H2O2诱导的HGFs细胞氧化应激损伤模型,检测Dh HP-6对HGFs细胞内ROS的生成、相关凋亡蛋白的活性以及抗氧化因子的表达等影响。研究发现Dh HP-6提高了HGFs细胞内抗氧化因子谷胱甘肽（glutathione,GSH）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的表达水平。此外,Dh HP-6可抑制HGFs细胞内ROS的生成,降低细胞内凋亡蛋白caspase3、caspase8和caspase9活性,同时Dh HP-6还降低了丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量以及HGFs细胞上清液TNF-α和IL-1β的表达量。结果表明,Dh HP-6对H2O2诱导的HGFs细胞具有良好的抗氧化应激损伤的作用。3、Dh HP-6对大鼠实验性牙周炎抗氧化及抗炎的作用效果建立大鼠实验性牙周炎模型,从体内角度检测Dh HP-6对大鼠牙周炎的治疗效果。结果表明,Dh HP-6有效提高各组大鼠牙龈组织以及血清中抗氧化酶SOD、CAT和抗氧化剂GSH的表达水平,降低大鼠血清氧化产物MDA的含量,同时降低血清和牙龈组织中TNF-α和IL-1β的含量,减轻大鼠牙周炎的炎症反应,并且Dh HP-6对牙周炎造成的牙槽骨吸收有保护作用。因此,Dh HP-6通过提高全身及局部组织内抗氧化酶和抗氧化剂的表达水平,降低氧化产物及细胞炎症因子的含量,对大鼠实验性牙周炎具有较好的治疗效果。

高源^[9]（2020）在《菊花提取物抗衰老作用研究》文中研究指明目的:菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序,具有平肝明目、清热解毒、疏风解郁的功效。菊花是一种药食两用品,汉《神农本草经》将其归为上品,认为“久服利血气,能轻身耐老延年”。现代研究发现菊花含有黄酮、三萜等活性成分,具有抗氧化、抗炎、保肝等多种药理作用。开封菊花历史悠久、资源丰富,但有关其药用价值的研究较少。本研究通过建立D-半乳糖致衰老模型,探讨开封菊花KFC-6醇提物及黄酮有效部位对衰老小鼠的抗衰老作用及其作用机制,以期为开封菊花新资源开发提供一定帮助。方法与结果:以开封菊花KFC-6为研究对象,提取制备得到KFC-6醇提物及黄酮有效部位。采用紫外分光光度法测定KFC-6醇提物及黄酮有效部位中总黄酮含量,醇提物总黄酮含量为13.49%,黄酮有效部位总黄酮含量为52.20%。将120只KM小鼠（雌雄各半）随机分成10组:空白对照组、D-半乳糖致衰老模型组、KFC-6醇提物低、中、高剂量组（即CL、CM、CH组,给药剂量分别为200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg）、KFC-6黄酮有效部位低、中、高剂量组（即HL、HM、HH组,给药剂量分别为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg）、芹菜素组（给药剂量为50 mg/kg）、阳性药维生素E组（即维E组,给药剂量为200 mg/kg）。除空白对照组外,各组小鼠每日于颈背部皮下注射300mg/kg D-半乳糖溶液,建立衰老模型。造模同时灌胃给药,实验共6周。给药期间观察记录小鼠体征变化;末次给药前5 d进行Morris水迷宫试验;末次给药后测定各组小鼠心、肾、肝、脾脏、胸腺的脏器指数,HE染色法观察小鼠肝组织病理形态学变化。结果表明KFC-6醇提物及黄酮有效部位可以缩短衰老小鼠逃避潜伏期、提高小鼠对原平台位置的记忆保持能力,改善衰老导致的学习记忆能力衰退,延缓模型小鼠大脑衰老;并发现KFC-6醇提物及黄酮有效部位可以改善模型小鼠衰老体征;进一步研究发现给予衰老小鼠KFC-6醇提物及黄酮有效部位可以提高模型小鼠肾脏、肝脏、脾脏、胸腺的脏器指数,逆转衰老导致的免疫、代谢功能下降,并能改善肝脏细胞形态、缓解肝组织损伤,发挥延缓器官衰老的作用。以上结果证明KFC-6醇提物及黄酮有效部位具有一定的抗衰老作用。进一步研究测定各组小鼠血清及脑、肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性及丙二醛（MDA）的含量;测定各组小鼠血清中炎症因子白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平;并采用蛋白免疫印迹法比较衰老小鼠肝组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平。结果表明KFC-6醇提物、黄酮有效部位能够提高衰老小鼠血、脑、肝中内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,减少脂质过氧化物MDA的产生,降低炎症因子IL-6、TNF-α的水平,有效降低D-半乳糖致衰老小鼠各组织及血清中氧化应激水平,抑制慢性炎症衰老状态;进一步研究表明KFC-6醇提物能够通过促进Nrf2向胞核内转移提高Nrf2下游靶向基因蛋白HO-1和NQO1的表达,从而调节衰老小鼠氧化应激水平。结论:本研究表明KFC-6醇提物及黄酮有效部位通过提高机体内抗氧化能力改善模型小鼠的衰老体征,保护各脏器免受自由基损伤,延缓器官衰老,进而发挥抗衰老作用,深入研究发现KFC-6的抗衰老作用可能与激活Nrf2/ARE信号通路有关。

卢建升^[10]（2020）在《大鼠HIRI模型中Hcy代谢与肝龙胶囊预处理的作用》文中提出目的:建立大鼠HIRI模型,观察氧化应激、Hcy及相关代谢酶在HIRI中的变化,以及肝龙胶囊对HIRI预处理的作用,为后续的研究奠定基础。方法:1、将60只SD大鼠随机分为Sham组、HI组和HIR组,其中HIR组设置4个再灌注时间段,包括HIR3 h组、HIR6 h组、HIR12 h及HIR24 h组,每组10只。建立大鼠HIRI模型,观察大鼠的生存情况与状态,肝组织HE染色观察病理学,确定大鼠HIRI模型建立情况。2、检测大鼠HIRI模型中血浆AST、ALT活力和肝组织的HA、LN含量,以及实时荧光定量PCR测定肝组织OPN、α-SMA mRNA表达水平,观察大鼠肝脏损伤情况。3、检测大鼠HIRI模型肝组织中XOD、GSH-Px、CAT、NOS及SOD的活力,和GSH、NO、MDA的含量,来验证氧化应激反应参与HIRI的发生。4、检测大鼠HIRI模型肝组织中Hcy的含量,实时荧光定量PCR测定大鼠肝组织MS、CβS、MTHFR、BHMT及ER-αmRNA的表达水平,评价Hcy及代谢、ER-α在HIRI中的作用。5、将40只SPF级SD大鼠随机分为5组,即正常对照组、模型组、肝龙胶囊（GL）低、中、高剂量组(60、120、240 mg·kg-1),每组8只。各组大鼠按1m L·100 g-1的给药容积灌胃相应剂量的药物或生理盐水,1次/d,持续14 d。末次给药结束后各组进行相应操作,并观察肝组织HE染色病理学变化,检测血浆中AST、ALT活力,测定肝组织中MDA、Hcy、HA、LN含量和XOD、SOD活力,来评价肝龙胶囊对大鼠肝脏缺血预处理的作用。结果:1、通过半肝血流阻断法阻断大鼠肝左叶和中叶的血供,使大鼠肝脏约70%肝组织缺血90 min后再灌注血流建立HIRI的模型成功诱导肝损伤,且建模动物存活率达83.3%。与Sham组和HI组比较,HIR组大鼠肝脏脏器系数的差异均无统计学意义（P>0.05）。2、HE染色结果显示,Sham组镜下可观察到肝组织汇管区及中央静脉结构正常完整,肝细胞呈索状排列整齐,大小均匀,形态正常,无变性和坏死,肝窦明显扩张;HI组肝细胞索状排列不整齐,分布不均匀,有少量变性和坏死,肝窦被挤压变形且有明显淤血,有较少炎性细胞浸润;HIR3 h组和HIR6 h组肝细胞排列不齐且不均匀,有少量变性与坏死,肝窦挤压变形且有大量红细胞滞留,有少量炎性细胞浸润;HIR12 h组和HIR24 h组肝细胞排列不整齐且分布均匀,大小不均匀,有不同程度变性、水肿与坏死,肝窦被挤压变形甚至消失且有红细胞淤滞。HIR组的肝组织损伤以HIR24 h组最为严重,其肝细胞出现水肿和局灶坏死,且有大量炎性细胞浸润。3、与Sham组和HI组比较,大鼠肝脏缺血且再灌注一定时间后,HIR组肝组织中XOD活力和NO、MDA含量均有不同程度上升,其中以HIR24 h组的升高最明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而GSH含量和GSH-Px、NOS、CAT及SOD活力不同程度下降,以HIR6 h组和HIR12 h组的下降最明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Sham组比较,HI组肝组织中SOD、GSH-Px活力下降,差异明显且有统计学意义（P<0.01）,而GSH、NO、MDA含量和XOD、CAT、NOS活力的变化差异无统计学意义（P>0.05）。4、与Sham组比较,HI组和HIR组大鼠血浆AST和ALT的活力均有不同程度的显着升高,差异均有统计学意义（P<0.01）,尤其以HIR6 h组和HIR12 h组两组活力的升高最明显;与HI组比较,HIR3 h、HIR6 h和HIR12 h组大鼠血浆的AST活力和HIR组大鼠血浆的ALT活力均有不同程度升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Sham组和HI组比较,HIR12 h组及HIR24 h组大鼠肝组织HA、LN含量均明显升高,差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。5、RT-q PCR结果显示,与Sham组和HI组比较,HIR6 h组、HIR12 h组和HIR24 h组大鼠肝组织OPN mRNA的表达量均不同程度显着增高,HIR组大鼠肝组织α-SMA mRNA的表达量也均不同程度显着增加,其中OPN、α-SMA mRNA的表达量增高以HIR24 h组明显,差异明显,有统计学意义（P<0.01）。HI组大鼠肝组织α-SMA和OPN mRNA的表达量较Sham组亦有增加,但差异没有统计学意义（P>0.05）。6、与Sham组和HI组比较,HIR12 h组和HIR24 h组大鼠肝组织中Hcy含量均显着升高,其中HIR24 h组含量最高,差异明显,具有统计学意义（P<0.01）。HI组大鼠肝组织中Hcy含量较Sham组升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与Sham组比较,HI组和HIR组大鼠肝组织的MS mRNA表达量均不同程度降低,CβS mRNA的表达量均增加;HIR6 h组、HIR12 h组及HIR24 h组大鼠肝组织MTHFR mRNA的表达量和HIR组大鼠肝组织的BHMT mRNA的表达量均有不同程度增加,差异均具有统计学意义（P<0.05）。其中MS mRNA的表达量在再灌注12 h时降低最明显,CβS与MTHFR mRNA的表达量在再灌注24 h时增高最显着,BHMT mRNA的表达量在再灌注6 h时增高最为明显。与HI组比较,HIR3 h组、HIR6 h组及HIR12 h组组大鼠肝组织的MS mRNA表达量均降低,而HIR24h组MS mRNA表达量增加,差异明显,有统计学意义（P<0.01）;HIR24 h组大鼠肝组织CβS mRNA的表达量显着增加,差异明显,有统计学意义（P<0.01）;HIR组大鼠肝组织MTHFR与BHMT mRNA的表达量增加,但差异无统计学意义（P>0.05）。7、研究结果发现,与模型组比较,大鼠在不同浓度的肝龙胶囊预处理后,肝组织病理形态均有不同程度改善;GL中剂量组大鼠血浆AST、ALT的活力明显降低（P<0.01）;GL低、中、高剂量组大鼠肝组织SOD活力不同程度升高（P<0.05）,MDA含量降低（P<0.05）,GL中、高剂量组大鼠肝组织活力和Hcy含量显着降低（P<0.01）;给药组大鼠肝组织HA、LN含量仅有GL中剂量组的下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、大鼠肝脏缺血-再灌注能引起肝脏损伤,再灌注加剧肝脏的损伤。2、验证了氧化应激参与HIRI的发生,其中初步将Hcy与HIRI联系研究发现,Hcy可能通过自身氧化产生大量活性氧损伤肝组织。4、HIRI导致MS基因表达异常,使Hcy甲基化径的代谢紊乱,导致Hcy在体内蓄积。5、一定剂量的肝龙胶囊对大鼠HIRI预处理具有保护肝脏作用,可能通过减轻Hcy的自身氧化作用和减少ROS的产生,以及提高抗氧化作用,减轻肝细胞的损伤。

二、应激时几个脏器中氧化和抗氧化作用变化的实验研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、应激时几个脏器中氧化和抗氧化作用变化的实验研究（论文提纲范文）

（1）大蒜素对肿瘤细胞的氧化还原影响研究（论文提纲范文）

（2）天然食材来源的抗氧化剂参与调控骨性关节炎氧化应激的相关研究（论文提纲范文）

（3）基于“TLRs信号通路”观察不同配穴对预防应激性胃溃疡“调衡防控”的分子机制研究（论文提纲范文）

（4）雾化吸入活性氧清除性纳米粒靶向治疗心力衰竭的研究（论文提纲范文）

（5）基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究（论文提纲范文）

（6）小分子IR-61改善STZ诱导的糖尿病大鼠排尿功能的实验研究（论文提纲范文）

（7）急性高山病和高原红细胞增多症的microRNA表达特征及其病理生理学意义研究（论文提纲范文）

（8）次血红素六肽生物功能及其对牙周炎治疗的研宄（论文提纲范文）

（9）菊花提取物抗衰老作用研究（论文提纲范文）

（10）大鼠HIRI模型中Hcy代谢与肝龙胶囊预处理的作用（论文提纲范文）

四、应激时几个脏器中氧化和抗氧化作用变化的实验研究（论文参考文献）

• [1]大蒜素对肿瘤细胞的氧化还原影响研究[D]. 潘烨灿. 中国农业科学院, 2021
• [2]天然食材来源的抗氧化剂参与调控骨性关节炎氧化应激的相关研究[D]. 杨君君. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
• [3]基于“TLRs信号通路”观察不同配穴对预防应激性胃溃疡“调衡防控”的分子机制研究[D]. 李丽. 长春中医药大学, 2021(01)
• [4]雾化吸入活性氧清除性纳米粒靶向治疗心力衰竭的研究[D]. 刘超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
• [5]基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究[D]. 付国庆. 武汉科技大学, 2021(01)
• [6]小分子IR-61改善STZ诱导的糖尿病大鼠排尿功能的实验研究[D]. 王建武. 重庆医科大学, 2021(01)
• [7]急性高山病和高原红细胞增多症的microRNA表达特征及其病理生理学意义研究[D]. 黄河. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
• [8]次血红素六肽生物功能及其对牙周炎治疗的研宄[D]. 闫嘉晴. 吉林大学, 2020(03)
• [9]菊花提取物抗衰老作用研究[D]. 高源. 河南大学, 2020(02)
• [10]大鼠HIRI模型中Hcy代谢与肝龙胶囊预处理的作用[D]. 卢建升. 大理大学, 2020(05)

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