一、线粒体与细胞凋亡（论文文献综述）
金涛,刘林,朱晓燕,史宇悰,牛建雄,张同同,吴树金,杨青山[1]（2022）在《骨关节炎与线粒体异常》文中指出背景:骨关节炎是一种与多种因素相关的慢性进行性的关节退行性疾病,而线粒体在其中发挥的作用不可忽视。目的:综述目前相关文献,总结线粒体与骨关节炎的关系,了解线粒体损伤在骨关节炎发病中的机制,为从线粒体途径治疗骨关节炎提供理论参考。方法:以"mitochondria;mitochondrial;osteoarthritis;ostarthritis; ostearthritis"为检索关键词,从Pub Med数据库中以检索式"（mitochondria） OR （mitochondrial） AND （osteoarthritis） OR （ostarthritis） OR （ostearthritis）"检索。初检得到2000-2021年发表的文献455篇,按纳入排除标准最终共入选61篇文献进行综述。结果与结论:（1）线粒体在骨关节炎病变中发挥了关键性的作用,在骨关节炎病变中,线粒体氧化还原的异常会抑制基质合成、激活基质金属蛋白酶降解基质成分、诱导细胞因子产生和诱导软骨细胞凋亡,进而促进软骨退行性病变;生物发生的缺乏会导致软骨细胞前分解代谢反应的加速;动力学异常时受损的线粒体会积累,导致线粒体不能产生足够的生物能量,调节钙并维持氧化还原状态从而加速骨关节炎的发展;有丝分裂受损时功能失调的线粒体不能被及时清除从而导致线粒体动态平衡的紊乱;遗传学异常时会导致线粒体呼吸和糖酵解增加,自由基和促炎细胞因子产生增加,细胞凋亡程度上升从而导致软骨细胞功能障碍;而钙调节异常时会导致活性氧过度产生,线粒体去极化及线粒体膜电位降低,进而使软骨细胞凋亡。（2）在骨关节炎的治疗方面,以内源性AMPK、SIRT、Parkin为靶点的药物,以及外源性的抗氧化剂,能够抑制线粒体凋亡和增强线粒体动力学的药物有望成为早期治疗骨关节炎的潜在药物。
李阿敏[2]（2021）在《煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应及其机制研究》文中提出背景及目的煤炭目前仍然是不可替代的重要能源之一。流行病学研究显示煤矿工人的肺癌发病率高于普通人群,这表明煤炭矿区环境污染物可能会增加罹患肺癌的风险。本课题以人支气管上皮细胞为模型,研究煤尘（coal dust,CD）暴露的潜在致癌效应及毒理机制;为煤尘风险评估和实施暴露控制提供实验证据。研究方法（1）回顾及总结煤尘暴露与肺癌风险之间关系的流行病学证据,以评估煤尘暴露是否与增加的肺癌风险相关。（2）将人支气管上皮细胞（BEAS-2B）暴露于煤尘条件下传代培养,细胞水平利用苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）、噻唑蓝比色法（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）、克隆形成实验、划痕愈合实验、间接免疫荧光、彗星实验、蛋白质免疫印迹和高通量测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）检测煤尘暴露后的细胞（BEAS-2BCD）的形态变化、增殖活力、迁移能力、DNA修复能力和基因组稳定性;动物水平将BEAS-2BCD细胞异种移植于BALB/c裸鼠,观察BEAS-2BCD细胞的体内成瘤潜能。综合评估煤尘暴露后的BEAS-2BCD细胞是否发生肿瘤样转化。（3）将煤尘短时暴露BEAS-2B细胞,通过HE染色、线粒体膜电位荧光探针、活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光探针、间接免疫荧光和蛋白质免疫印迹探讨煤尘暴露引起的应激损伤机制;在此损伤机制的研究基础上,利用蛋白质免疫印迹、细胞免疫化学染色、逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）、Annexin V-FITC/PI染色以及流式细胞术探究煤尘慢性暴露诱导BEAS-2BCD细胞肿瘤样转化的可能毒理机制。研究结果（1）Meta分析结果显示煤尘暴露与肺癌的相对风险（relative risk,RR）为1.46（95%CI 1.29-1.66）,表明煤尘暴露者发生肺癌的危险性为非暴露者的1.46倍,提示煤尘暴露与肺癌呈正相关关系,煤尘暴露是肺癌的一个危险因素。（2）煤尘暴露条件下培养30代后的人支气管上皮细胞（BEAS-2BCD）肿瘤样转化相关生物学表征:1)形态表征:BEAS-2BCD细胞体积增大,胞核增大,核质比例失常,核深染,核仁增多,较正常BEAS-2B细胞形态发生了显着异化。2)功能表征:BEAS-2BCD细胞培养24h、48h、72h、96h的平均活力分别为0.64、0.75、0.78、0.85,较正常培养相同代数的 BEAS-2B 细胞（0.46、0.65、0.67、0.73）显着增高（p<0.05）。同时,BEAS-2BCD细胞31.10%的平均克隆形成率较BEAS-2B细胞（10.13%）提高三倍之多（p<0.01）。并且,BEAS-2BCD细胞24h的平均迁移率（50.83%）也显着高于BEAS-2B细胞（17.71%）（p<0.01）。提示BEAS-2BCD细胞的增殖活力及迁移能力显着增强。此外,顺铂处理24h时,BEAS-2BCD细胞内DNA断裂的γ-H2AX焦点均数（18个/细胞）明显少于BEAS-2B细胞（26个/细胞）（p<0.05）;去除顺铂并继续培养12h和24h时,BEAS-2BCD的γ-H2AX焦点均数分别为9个/细胞和4个/细胞,均显着少于BEAS-2B细胞（22个/细胞和15个/细胞）（p<0.05）。彗星实验显示顺铂处理24h及去除顺铂12h和24h时,BEAS-2BCD细胞的DNA损伤率（15%、8%、3%）亦明显低于BEAS-2B细胞（19%、14%、10%）（p<0.05）。同时蛋白质印迹显示BEAS-2BCD细胞内DNA修复酶ATM/ATR和DNA-PKcs磷酸化水平均高于BEAS-2B细胞（p<0.05）。以上结果证实BEAS-2BCD细胞DNA修复能力显着增强,提示其对外界环境的适应性及抗凋亡能力显着提高;3)基因组转录表征:NGS检测结果显示BEAS-2BCD细胞基因组不稳定。促增殖、迁移,抗凋亡相关基因（CXCR4、CASC9、CNPY2、CRNDE、FAM83A、EGFR、BCAT1、HMGA1、NSUN2、ANKHD1、ZNF326 等）表达显着增加;原癌基因（MET、MYC、FYN、ABL2、ATF1、SET、ETS2等）显着高表达,抑癌基因（ADARB1、GLIPR1、CDO1、CTDSPL、DLC1、TOM1L2 等）表达明显降低;细胞跨膜信号转导（整合素、EGFR、VEGF、PDGF等）、胞内信号传导（PI3K/AKT、MAPK、mTOR等）相关通路显着上调。表明煤尘暴露后的BEAS-2BCD细胞较BEAS-2B细胞具有显着增强的新陈代谢活动、自我更新能力、增殖、迁移、血管生成、损伤修复抗凋亡等肿瘤样转化相关生物学活性。4)体内成瘤表征:动物实验结果显示BEAS-2BCD细胞的新生物形成率为20%,终点体积为726.0mm3,肺腺癌细胞株H358阳性对照组的新生物形成率为60%,平均体积为2088.2mm3。新生物组织HE染色显示BEAS-2BCD组细胞呈混合性生长,细胞间伴有较多组织细胞反应,细胞核异型较明显。Ki-67免疫组化可见BEAS-2BCD组Ki-67阳性细胞比例较高,已接近H358阳性对照组,提示BEAS-2BCD细胞的增殖能力较强。BEAS-2BCD细胞荷瘤模型的建立,表明该细胞具有体内成瘤潜能。（3）机制研究结果显示煤尘短时暴露引起了 BEAS-2B细胞线粒体膜去极化（0h:3.79%,6h:6.45%,12h:17.34%,24h:25.03%）。ROS 生成显着增加（0h:4.08;6h:21.13,12h:75.46,24h:30.75）;线粒体凋亡通路蛋白 Caspase-9、Caspase-3和DFF45活化,两者共同诱导DNA断裂效应。煤尘暴露培养10代、20代和30代的BEAS-2B细胞内DNA修复酶ATM/ATR和DNA-PKcs,及相关联的通路蛋白AKT、mTOR、p70S6K、4E-BP1、EGFR和ERK磷酸化水平较正常BEAS-2B细胞显着增高,提示DNA断裂损伤激活了煤尘暴露细胞内同源重组（Homologous recombination,HR）和非同源末端连接（Non-homologous end-joining,NHEJ）两条DNA修复途径及其相关联的信号通路AKT/mTOR和EGFR/ERK。AKT、EGFR、ERK 抑制剂（MK-2206 2HC1、Gefitinib、LY3214996）的应用能显着降低BEAS-2BCD细胞的增殖活力、迁移能力,抑制细胞的周期进展并促进细胞的凋亡效应。其中ERK抑制剂（LY3214996）还显着降低了下游原癌基因转录因子MYC、ATF1和ETS2的磷酸化水平。以上结果表明AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路的异常活化在BEAS-2BCD细胞肿瘤样转化相关生物学活性中可能发挥重要作用。结论及意义（1）煤尘暴露可增加肺癌风险,是肺癌的危险因素之一。（2）煤尘暴露能诱导人支气管上皮细胞过度增殖、迁移、抗凋亡、基因组不稳定以及体内成瘤潜能等肿瘤样转化。（3）煤尘暴露可通过线粒体膜去极化,ROS生成和线粒体凋亡通路活化,驱动DNA损伤,激活DNA修复途径及其相关联的信号通路AKT/mTOR和EGFR/ERK等,可能是诱发人支气管上皮细胞肿瘤样转化重要的毒理机制之一。本研究结果为煤尘暴露的潜在致肺癌作用提供了新的实验证据,为进一步阐明相关肺癌致病机理提供了研究思路,具有一定的职业危害防控价值。图26表13参214
何嘉欣[3]（2021）在《紫丁香苷的提取分离工艺优化及对HGC-27细胞增殖抑制作用机制研究》文中研究说明紫丁香苷（xanthotoxin）化学名称为 Syringoside,又名（2R,3S,4S,5R,6S）-2-羟甲基-6-[4-[E)-3-羟基丙-1-烯基]-2,6-二甲氧基苯氧基]氧杂环己烷-3,4,5-三醇,现有研究表明,刺五加中有效成分紫丁香苷有显着抗肿瘤作用。目前对紫丁香苷抗肿瘤作用机制的药理研究较少,且目前紫丁香苷单体的提取分离工艺不成熟,导致紫丁香苷单体的生产成本较高,因此对紫丁香苷单体的提取分离工艺及其对治疗疾病产生作用机制的药理研究具有重要研究意义。本文采用乙醇回流提取法进行提取分离,将影响因素设定为乙醇浓度、提取时间和提取次数,乙醇浓度设置50%,75%,95%三个梯度,提取时间设置1h,1.5h,2h三个梯度,提取次数分别为1次,2次,3次,采用正交试验法对三因素进行设计,并测定不同条件下紫丁香苷的含量。实验结果表明,乙醇回流法从刺五加中提取紫丁香苷的最佳工艺条件为75%乙醇提取1.5h。在此基础上,用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对提取物进行萃取,经硅胶柱层析和纯化分离得到紫丁香苷,采用HPLC法测定对紫丁香苷标准品和提取的紫丁香苷样品进行纯度检测,标准品纯度为99.7425%,紫丁香苷样品纯度为95.1882%。以胃癌HGC-27细胞为研究对象,MTT法检测出紫丁香苷对于HGC-27细胞的增殖抑制作用明显,紫丁香苷的IC50值175.29μmol/L;HE染色结果紫丁香苷对于HGC-27细胞有显着细胞毒作用;细胞克隆形成实验结果显示,紫丁香苷作用下,HGC-27细胞克隆形成率分别为低剂量组68.20±2.771%,中剂量组22.82±1.769%,高剂量组15.0±1.2290%,P<0.05,实验说明紫丁香苷对于胃癌HGC-27细胞具有显着的增值抑制作用。为进一步研究紫丁香苷抗肿瘤作用机制,本研究采用网络药理学方法,应用Swiss TargetPrediction数据库预测得紫丁香苷靶点18个;GeneCards、OMIM、DiGseE数据库预测胃癌相关靶点蛋白11842个;应用软件Venny 2.1和Cytoscape 3.2.1构建紫丁香苷-抗胃癌网络,得交集靶点17个;应用String数据库和软件Cytoscape 3.2.1构建蛋白质相互作用网络,通过分子对接分析得出紫丁香苷—抗胃癌作用核心靶点有12个,Bax蛋白和Bcl-2蛋白关联的蛋白最多;应用DAVID数据库进行GO功能富集分析得到50个GO生物过程和29个KEGG通路,在靠前的20个生物过程和通路中线粒体细胞凋亡通路涉及10个核心靶点,凋亡通路包含7个核心靶点,综合评定GO功能富集结果,预测出紫丁香苷抗胃癌作用与诱导胃癌细胞凋亡最为相关,可能通过调控Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达诱导细胞凋亡。对网络药理学预测结果进行验证,进行以下实验:PI单染法检测紫丁香苷诱导HGC-27细胞凋亡情况,结果显示给药组细胞凋亡率明显高于空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）,表明紫丁香苷确能诱导HGC-27细胞凋亡,中剂量组（180μmol/L）HGC-27细胞的凋亡率最高;免疫组化法检测紫丁香苷对HGC-27细胞内Bax、Bcl-2两种蛋白活性的影响,结果显示随着紫丁香苷给药剂量逐渐升高,HGC-27细胞内Bax蛋白活性逐渐增强、BCL-2蛋白活性呈逐渐降低趋势,与空白组差异具有统计学意义（P<0.05）;流式细胞仪检测细胞周期结果显示,紫丁香苷作用HGC-27细胞48h后,与空白对照组比较G0/G1期的峰高逐渐增加,并且有显着差异（P<0.01）,空白对照组值为22.100±1.513;紫丁香苷给药组低、中、高组值分别为33.433±1.002、37.233±1.168、71.467±0.833,对HGC-27细胞周期阻滞明显,紫丁香苷给药组G0/G1期细胞达到70%以上,随剂量的增大数量增多。综上所述,文章提出采用乙醇回流提取法从刺五加原药材中提取紫丁香苷,最佳提取条件为乙醇浓度75%,提取时间为1.5h,经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取,硅胶柱层析、纯化,分离得出紫丁香苷纯度95.1882%,为紫丁香苷提取工业化提供研究基础。此外紫丁香苷对HGC-27细胞有细胞毒作用,其有效机制一是通过同时上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达诱导细胞凋亡,二是通过将细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制其增殖,实验结果为紫丁香苷临床靶向药物研发提供理论基础。
王新慧[4]（2021）在《健脾祛湿和络方上调线粒体自噬减少被动Heymann肾炎大鼠足细胞调亡的机制研究》文中认为特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy,IMN）是成人肾病综合征的最常见原因,发病率逐年增加,经积极治疗仍有1/3患者起病的5-10年内进展至终末期肾脏病,寻找针对IMN安全有效的新治疗策略迫在眉睫。持续大量蛋白尿是IMN肾功能进展的危险因素,足细胞损伤或耗竭是肾小球滤过屏障受损,蛋白尿产生的关键,足细胞凋亡则是足细胞损伤的主要形式。因此,减少足细胞凋亡对IMN蛋白尿的治疗具有重要意义。健脾祛湿和络方（jianpiqushiheluo formula,JQHF）临床疗效显着,可以减少蛋白尿,延缓肾功能进展。JQHF减少蛋白尿的机制,是否是通过减少足细胞凋亡,改善肾小球滤过膜损伤,有待阐明。此外,肾小球上皮下免疫复合物沉积是IMN最主要的病理表现。免疫复合物激活补体系统可以产生亚溶量C5b-9,插入足细胞膜,导致局部ROS的产生。当细胞内ROS累积超过线粒体的抗氧化能力时,氧化应激可以引起线粒体功能障碍,继而激活线粒体途径的细胞凋亡通路。线粒体自噬,则是降解、再回收受损和多余线粒体,以及维持细胞生存的重要机制。哺乳动物体内线粒体自噬的调控途径主要有3种:PINK1/Parkin途径、BNIP3L途径和FUNDC1途径。其中,PINK1的激活,被认为是诱导线粒体自噬的起始事件,在线粒体自噬过程中发挥重要作用。本实验以PINK1/Parkin通路对细胞凋亡的调控机制为切入点,展开研究。JQHF是否可以通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,清除损伤线粒体,减少足细胞凋亡,发挥肾脏保护作用,是本次研究的重点。研究的主要内容如下。目的:本研究构建被动Heymann肾炎（passive Heymann nephritis,PHN）大鼠模型,模拟人类IMN肾脏病理损伤的机制,旨在探讨:1、JQHF对PHN大鼠的肾脏保护作用;2、JQHF对PHN大鼠线粒体功能障碍及足细胞凋亡的影响;3、JQHF调控PINK1/Parkin线粒体自噬通路对足细胞凋亡的保护作用。方法:使用绵羊抗大鼠FX1A血清建立PHN模型,分为模型组,盐酸贝那普利组,JQHF低、高剂量组、JQHF（低剂量）+3-MA干预组,另设正常组,给予相应药物灌胃。药物干预的第0、2、4、6周留取24小时尿液标本,药物干预6周后留取血清、肾组织标本。检测指标及方法:1、血清、尿液标本:全自动生化分析仪检测24小时尿蛋白定量（24h UTP）、ALB、TC、TG、AST、ALT、BUN、Scr;2、肾脏病理:免疫荧光染色观察肾小球IgG、C5b-9沉积情况;电镜,光镜HE、PAS、Masson染色观察大鼠肾脏病理改变;3、线粒体功能检测:电镜观察线粒体超微结构改变;流式细胞术检测线粒体膜电位以及细胞内ROS水平;4、细胞凋亡检测:TUNEL法检测肾小球、肾小管细胞凋亡;免疫组化检测足细胞标志蛋白WT-1、Nephrin表达;Western bolt检测Nephrin蛋白表达;5、PINK1/Parkin通路相关蛋白检测:免疫荧光染色观察肾小球内PINK1-Parkin,COX Ⅳ-LC3 共定位情况;Western bolt 检测肾组织中 PINK1,LC3-Ⅱ/Ⅰ,Cleaved caspase-3,Cyt c,Cyto-Parkin,Mito-Parkin 蛋白表达。结果:1、JQHF对PHN大鼠的肾脏保护作用（1）24h UTP比较:与给药前相比,模型组在给药6周时,24h UTP显着增多;给药6周时,与模型组、盐酸贝那普利、JQHF+3-MA组比较,JQHF低剂量组24h UTP显着降低（P<0.01,P<0.05,P<0.05）,JQHF高剂量与模型组比较也有降低（P<0.01）。（2）肾功能、血脂、肝功能指标比较:与空白组比较,模型组血清ALB减少,TC升高;与模型组比较,JQHF低剂量组ALB、TC指标显着改善（P<0.01,P<0.05）;联合使用3-MA,显着抑制了 JQHF对ALB的改善作用（P<0.01）;BUN的比较中,与模型组比较,JQHF低、高剂量组有明显下降（P<0.05,P<0.01）,其余组间无差异;TG、Scr、ALT、AST的水平比较,各组间均无明显差异;（3）肾脏病理损伤比较:与空白组比较,模型组肾脏病理损伤加重;与模型组比较,JQHF低、高剂量组肾小管间质损伤评分、肾小球数目增多、IgG沉积均有显着改善,C5b-9沉积仅有JQHF低剂量组减少明显（P<0.01）;与盐酸贝那普利组比较,JQHF低剂量组肾小管损伤评分、肾小球细胞数目也有显着降低（P<0.05,P<0.05）。3-MA+JQHF组与JQHF低剂量组比较,肾脏病理损伤加重,以上各项指标的比较均有显着差异。2、JQHF对PHN大鼠线粒体功能障碍及足细胞凋亡的影响（1）线粒体超微结构及膜电位:与空白组比较,模型组足细胞内线粒体肿胀变圆,外膜增厚,空泡样变,伴有嵴模糊以及排列紊乱,线粒体膜电位下降（P<0.01）;与模型组比较,各药物治疗组线粒体超微结构有不同程度改善,JQHF低、高剂量组改善最为明显,嵴结构基本正常,线粒体膜电位亦有显着增加（P<0.01,P<0.05）。3-MA显着抑制了 JQHF对线粒体超微结构以及膜电位的改善作用。（2）细胞内ROS水平:与空白组比较,模型组大鼠细胞内ROS水平显着升高;与模型组比较,盐酸贝那普利组,JQHF低、高剂量组ROS水平均有显着降低（P<0.05,P<0.001,P<0.01）;JQHF低剂量对ROS的清除作用,明显优于盐酸贝那普利组以及3-MA+JQHF组（P<0.05,P<0.001）。（3）肾小球、小管细胞凋亡:与空白组比较,模型组、盐酸贝那普利组、3-MA+JQHF组肾小管、肾小球细胞凋亡率均明显上升（P<0.001,P<0.05,P<0.01）;JQHF低、高剂量组的细胞凋亡率有改善,与空白组比较无明显差异;JQHF低剂量组肾小球细胞凋亡减轻最显着,较模型组有明显下降（P<0.05）。（4）足细胞数目及标志蛋白表达:与空白组比较,模型组足细胞数量显着减少;与模型组比较,盐酸贝那普利组、JQHF低、高剂量组足细胞数量均显着增多（P<0.001）;JQHF组与盐酸贝那普利组、3-MA+JQHF组比较,足细胞数量也有明显增加（P<0.001）。Nephrin蛋白表达方面,免疫组化与Western bolt结果一致,与模型组比较,JQHF低剂量组Nephrin表达显着增加;3-MA可以抑制JQHF对Nephrin的上调作用。3、JQHF调控PINK1/Parkin线粒体自噬通路对足细胞凋亡的保护作用（1）PINK1、Parkin蛋白表达:与空白组比较,模型组大鼠肾小球内PINK1、Mito-Parkin 蛋白表达降低（P<0.001,P<0.05）,Cyto-Parkin 表达增加（P<0.01）,PINK1-Parkin 荧光共定位系数 Pearson’s correlation 下降（P<0.001）,提示模型组PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬被抑制;与模型组比较,盐酸贝那普利组,JQHF低、高剂量组的PINK1、Mito-Parkin、Cyto-Parkin蛋白表达以及PINK1-Parkin共定位表达均有改善,差异显着;JQHF低剂量对以上指标的改善作用优于盐酸贝那普利;3-MA抑制自噬可以阻断JQHF对PINK1、Parkin的调控。（2）LC3、COX Ⅳ蛋白表达:与空白组相比,模型组、JQHF+3MA组肾小球LC3与COX Ⅳ（线粒体标记蛋白）荧光共定位系数Pearson’s correlation显着下降;与模型组比较,JQHF低剂量组的共定位表达显着增加（P<0.05）。与空白组比较,模型组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显着降低;与模型组、盐酸贝那普利组比较,JQHF低、高剂量组的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显着升高（P<0.001,P<0.001）。3-MA抑制了 JQHF对LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的调控。（3）凋亡因子（Cleaved caspase-3、Cyt c）表达:与空白组比较,模型组的Cleaved caspase-3、Cyt c 表达显着升高（P<0.001,P<0.001）;盐酸贝那普利组,JQHF低、高剂量组凋亡因子的表达均较模型组显着降低;JQHF低剂量的调节作用则优于盐酸贝那普利以及3-MA+JQHF。结论:（1）JQHF可以减少PHN大鼠24h UTP,提高血清ALB水平,药效作用显着优于盐酸贝那普利。JQHF可以减轻肾脏病理损伤,表现为减少肾小球内IgG、C5b-9免疫荧光沉积以及减轻肾小管损伤、改善肾小球内细胞数目增多。（2）PHN大鼠足细胞内存在ROS累积以及线粒体功能障碍,JQHF可以减少细胞内的ROS累积,改善足细胞线粒体超微结构,抑制线粒体膜电位下降,同时减轻足细胞以及肾小管细胞的凋亡。（3）JQHF可以显着上调肾小球内PINK1蛋白的表达,促进胞浆Parkin向线粒体转移,增加LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化以及LC3-Ⅱ与线粒体的结合,改善细胞内的线粒体自噬流,进而下调凋亡因子Cyt c,Cleaved caspase-3的表达。（4）3-MA可以显着阻断JQHF对PINK1/Parkin通路的激活,同时抑制JQHF对PHN大鼠足细胞凋亡,24h UTP以及肾脏病理损伤的改善作用。由此证实,JQHF是通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,促进损伤线粒体的清除,改善线粒体功能障碍,减少凋亡因子Cyt c、Cleaved caspase-3的释放,继而减轻足细胞损伤,减少蛋白尿,发挥肾脏保护作用。
金永哲[5]（2021）在《Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制》文中认为胃癌作为引起人类死亡四大癌症之一,对人类的健康状况及生命安全造成了极大的威胁。由于胃癌前期的症状不明显,导致大多数胃癌患者在被诊断出时已经处于疾病的中期或晚期状态。正是这种情况,给胃癌的临床治疗带来了非常大的困难度和复杂性。目前,外科手术切除、放射疗法、化学疗法、靶向疗法和细胞疗法等治疗方法是临床治疗胃癌的主要医学方法。但是由于手术治疗风险大且具有反复性、放疗会对身体正常的组织细胞造成不可逆的损伤、化学药物可能会再治疗癌症的同时产生严重的副作用、细胞治疗手段虽然相对安全可靠,但其高昂的治疗成本和治疗手段相对不成熟的原因,致使胃癌的临床治疗还存在着众多问题。近年来,改变肿瘤局部微环境治疗各类癌症已然成为科学家研究的热点。肿瘤微环境与人体正常内环境的生理活性有很大不同,肿瘤组织的核心部分往往因其大量的细胞增殖长时间处于低氧或缺氧的环境,因此造成癌细胞中的ROS水平急剧上升。细胞内的ROS具有调节细胞的增殖、代谢等作用,与肿瘤的发生与和治疗密切相关。因此,有效地调控癌细胞内ROS水平诱导癌细胞凋亡,是一种治疗胃癌的新的突破口和研究思路。过氧化物还原酶V（Prx Ⅴ）是一种能够清除细胞内ROS并调节细胞凋亡的抗氧化酶,它能降低过氧化氢、烷基过氧化氢和过氧化亚硝酸盐,清除细胞内ROS,维持细胞内氧化还原平衡,减少由细胞内氧化应激引起的氧化损伤,然后激活相关的下游信号通路来调节细胞凋亡。它是过氧化物酶还原酶家族的成员,广泛分布于细胞质、线粒体和过氧化物酶体中,并在多种癌症中异常表达。因此,在本研究中我们利用大黄素和盐酸阿霉素这两种可以引起细胞内ROS水平升高的药物处理人胃癌AGS细胞系,诱导细胞中ROS水平的增加进一步诱导AGS细胞凋亡。同时,我们使用慢病毒载体在基因水平上改变AGS细胞中Prx Ⅴ蛋白水平将其沉默或过表达。为了探究Prx Ⅴ在由于高水平ROS引起的胃癌细胞凋亡过程中的调控作用以及可能存在的作用原理及其机制。第一部分Peroxiredoxin Ⅴ通过ROS/Bc12信号通路抑制大黄素诱导的胃癌细胞凋亡目的:探讨Prx Ⅴ在大黄素诱导胃癌AGS细胞系的细胞凋亡过程中的调控作用。方法:使用DCFH-DA染色通过流式细胞术检测大黄素处理不同时间的AGS细胞中ROS水平的变化。利用Annexin V-FITC和PI双染通过荧光显微照相和流式细胞术检测处理不同时间的大黄素处理AGS细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹法检测大黄素在不同时间处理的AGS细胞中Prx家族蛋白的表达变化。然后加入NAC,即用ROS清除剂预处理细胞后,进行流式细胞仪检测细胞凋亡,然后用蛋白免疫印迹法检测Prx家族每个成员在细胞中蛋白表达水平的变化。利用慢病毒载体转染AGS细胞系,构建可以稳定遗传的空白载体组（Mock）、Prx Ⅴ沉默组（shPrx Ⅴ）和Prx Ⅴ过量表达组（Prx Ⅴ-his）细胞系,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞转染情况。用流式细胞仪检测大黄素在不同时间和浓度下处理的三种细胞的凋亡变化情况和细胞内ROS的变化。通过蛋白质免疫印迹法检测大黄素处理三种细胞不同时间时细胞凋亡相关蛋白质表达情况。结果:大黄素能够显着降低AGS细胞存活率,同时以时间依赖性和浓度依赖性方式显着提高细胞内活性氧水平诱导胃癌细胞发生凋亡,在此过程中蛋白免疫印迹结果显示Prx Ⅴ的表达具有显着性差异;Prx Ⅴ的过度表达可显着降低大黄素诱导的AGS细胞中ROS的水平。同时,Prx Ⅴ的过表达可以调节促凋亡蛋白Bad和Cleaved-PARP的表达状况,并上调抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平。在加入ROS清除剂后细胞内活性氧水平以及细胞凋亡情况明显下降。结论:1.大黄素可以通过增加细胞中ROS的表达水平来诱导AGS细胞凋亡。2.随着大黄素处理时间的增加,AGS细胞中Prx Ⅴ蛋白的表达水平降低。3.Prx Ⅴ表达含量可以调控大黄素诱导AGS细胞凋亡的程度。第二部分沉默Peroxiredoxin Ⅴ基因提高阿霉素诱导的胃癌细胞线粒体依赖性凋亡目的:探究Prx Ⅴ对阿霉素诱导的AGS胃癌细胞凋亡的可能调控作用及其机制。方法:利用慢病毒载体转染AGS细胞系,构建可以稳定遗传的空白载体组（Mock）和Prx Ⅴ沉默组（shPrx Ⅴ）细胞系,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞转染情况。利用MTT法检测不同浓度阿霉素处理对两种细胞的细胞存活率的影响,利用Annexin V-PE染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同时间以及不同浓度的阿霉素处理后两种细胞的细胞凋亡情况,利用DHE染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞内ROS水平的产生情况,利用MitoSOX染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞线粒体内ROS水平的产生情况,利用JC-1染色通过荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞线粒体膜电位变化情况,通过蛋白质免疫印迹法检测处理不同浓度时,细胞凋亡相关蛋白质的表达情况。结果:Prx Ⅴ基因沉默可能通过加重细胞内ROS的积累而显着增加阿霉素诱导的细胞凋亡。我们还发现,阿霉素诱导的线粒体ROS水平和膜通透性改变在shPrx Ⅴ细胞中明显高于Mock细胞,并且这些现象在加入NAC显着逆转。Prx Ⅴ基因沉默也显着上调了剪切的Caspase 9、3和Bax相关的细胞死亡相关蛋白表达水平。结论:1.沉默细胞内Prx Ⅴ表达水平可以增加AGS细胞对阿霉素药物的敏感性。2.沉默细胞内Prx Ⅴ表达水平会导致细胞内及线粒体内的ROS水平蓄积增加。3.预处理NAC可以有效缓解由于阿霉素引起的细胞凋亡。
杨学亮[6]（2021）在《血根碱对线粒体自噬的抑制作用及其毒性作用研究》文中指出血根碱（Sanguinarine,SAN）是一种植物来源的苯并菲啶生物碱,具有抗肿瘤、抗炎、杀菌、抗病毒等广泛的生物学活性。线粒体自噬可以调节线粒体质量,淘汰受损线粒体,过高或者过低的线粒体自噬水平都会严重影响细胞正常的机能,线粒体自噬与帕金森疾病、心脏相关性疾病等都有密切关系。为进一步探究血根碱生物活性及其分子机制和其他生物学活性,本文研究了血根碱对线粒体自噬（PINK1/Parkin信号通路）的调节活性及其分子机制,并通过体内斑马鱼模型和细胞模型研究了血根碱对斑马鱼心脏、神经系统和发育的毒性作用,本论文的目标是研究SAN对线粒体自噬的调控作用及其分子机制,以及对神经系统、心脏发育及其他器官的发育毒性。方法与结果:SAN对于线粒体自噬的抑制作用利用羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理转基因细胞系Hela-PINK1或Hela-Parkin建立细胞自噬模型;通过不同浓度的SAN进行处理,不同时间点在显微镜下观察PINK1和Parkin蛋白在细胞内的定位和表达变化,以确定SAN对于线粒体自噬的处理浓度依赖性和处理时间依赖性。利用蛋白质印迹法（Western Blot）进一步研究了SAN对于自噬标志蛋白LC3B、P62和线粒体外膜受体蛋白TOM20的蛋白表达影响,进一步明确SAN对线粒体自噬的抑制作用及相关分子机制。实验结果表明:CCCP能够引起线粒体自噬,导致PINK1稳定性增加,蛋白表达上调,并向线粒体迁移;增加Parkin蛋白在线粒体上的迁移和定位;同时上调了细胞自噬标志蛋白LC3B、P62以及线粒体外膜蛋白TOM20的表达水平;而SAN处理能够显着的抑制由CCCP诱导的线粒体自噬的发生,抑制PINK1的表达和线粒体定位,并抑制Parkin在线粒体的共定位,并且抑制由CCCP引起的LC3B、P62等表达水平的变化。SAN通过抑制线粒体自噬导致神经毒性选用24 hpf至144 hpf的斑马鱼评估SAN的神经毒性,选择1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP,一种传统的神经损伤造模剂）作为阳性对照,药物处理组分别单独以SAN处理和SAN以及N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC,一种ROS抗氧化剂）共处理斑马鱼,并通过显微成像和RT-PCR等方法进行了斑马鱼幼鱼神经元发育检测、脑部血管发育检测、脑部凋亡细胞检测、行为学检测以及神经损伤和线粒体自噬相关基因的基因表达水平检测。除此之外,为了进一步研究SAN的毒性作用机制,我们选用PC12神经细胞,进行SAN的体外毒性研究,我们利用SAN和NAC处理PC12细胞,然后进行了Hoechst33342-PI双染的凋亡检测、Ed U增殖水平检测和ROS活性氧水平检测,除此之外,利用Western Blot检测SAN和NAC处理PC12造成的α-syn、TH、caspase3、PARP、BAX、Bcl2、PINK1、Parkin的蛋白水平变化。结果表明:与空白对照组比较,MPTP阳性对照处理组的斑马鱼神经元发育迟缓并且呈现缺失的现象,脑部细胞凋亡水平上升,血管缺失,线粒体自噬和神经损伤相关基因表达异常;与MPTP处理组比较,SAN处理组具有类似的帕金森疾病症状,且呈现浓度依赖性,而NAC加入后,神经元凋亡水平显着下降,表明ROS参与了SAN诱导的凋亡过程。体外毒性研究结果表明,SAN能够诱导PC12细胞凋亡和ROS水平的提升,增殖能力的下降。而添加NAC后,PC12细胞内ROS水平显着下降,细胞凋亡水也明显降低,这表明ROS介导了凋亡的发生。SAN通过线粒体自噬引发心脏毒性我们使用48 hpf至96 hpf的斑马鱼幼鱼评估了SAN在体内的心脏毒性,使用SAN和NAC处理48hpf斑马鱼,处理至96hpf,随后进行了胚胎发育检测、心脏发育的结构和功能检测、心脏组织病理学切片染色、血细胞染色、心脏部位细胞凋亡检测、肠下静脉（SIVs）发育检测以及利用real-time PCR技术检测了心脏发育、血管生成、凋亡等基因表达水平。为了进一步研究SAN的毒性作用机制,我们选用心肌细胞HL-1细胞系,进行SAN的体外毒性研究。我们利用SAN和NAC处理HL-1细胞,然后进行了Hoechst33342-PI双染的凋亡检测、Ed U增殖水平检测和ROS活性氧水平检测。此外,利用Western Blot检测SAN和NAC处理后,PUMA、caspase3、PARP、BAX、Bcl2、caspase9、p-P38、p-Erk、p-JNK等蛋白表达水平变化。结果表明:SAN可导致心脏发育过程中的结构和功能异常,包括心率下降、红细胞数量减少、血流动力学变化、心肌细胞凋亡、SV-BA距离增加、肠下静脉充血。TUNEL法和AO染色结果表明斑马鱼心肌细胞发生凋亡。RT-PCR结果表明,SAN可以改变在心脏发育和功能中起关键作用的基因的表达水平,如:sox9b,myl7,nkx2.5和bmp10;此外,凋亡相关基因:caspase3,caspase9,bax和bcl2也被SAN改变。体外结果表明:SAN能诱导心肌细胞系HL-1细胞凋亡和ROS水平显着增加。western blotting结果显示MAPK途径（JNK和P38）显着增强,并参与SAN诱导的心脏毒性。我们的发现将更好地了解了SAN对心脏的毒性作用。血根碱引发的斑马鱼发育毒性为了对SAN的毒性作用有更全面的了解,我们利用斑马鱼模型进行了系统性的发育毒性研究,选用了4hpf的斑马鱼进行SAN处理,处理至96hpf后,对发育毒性、死亡率、畸形率、孵化率进行记录,并且进行心脏发育毒性检测、肝脏发育毒性检测、神经元发育检测、行为学检测、抗氧化系统和斑马鱼体内氧化水平检测,斑马鱼体内凋亡细胞检测,以及利用real-time PCR检测了和Nrf2通路、Wnt通路、凋亡、线粒体自噬相关基因表达水平。结果表明:与对照组相比,SAN处理可导致斑马鱼胚胎和幼鱼畸形率显着增加,心包水肿和脊柱弯曲;SAN处理组斑马鱼幼鱼的孵化率和体长显着降低;SAN还影响心脏,肝脏和神经系统的发育。进一步的研究表明,ROS活性氧水平显着增加,总超氧化物歧化酶的活性显着降低,丙二醛浓度显着升高。与对照组相比,在SAN处理组中检测到更多的凋亡细胞。另外,基因表达结果表明,在SAN处理组中,氧化应激,凋亡途径被诱导,而Nrf2和Wnt途径被抑制。综上所述,这些结果将有助于理解由SAN引起的毒性及其潜在的分子机制。
李华[7]（2021）在《川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究》文中研究表明背景结肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤之一,在我国,其发病率及死亡率呈逐年上升趋势,多数患者就诊时已属于中晚期。针对晚期及复发患者,化疗是主要的治疗手段,但化疗药物存在较强的毒副反应以及药物耐药的出现严重影响结肠癌患者的治疗效果及预后。因此,亟待寻找新型的抗肿瘤药物为结肠癌患者提供新的治疗手段。传统中药是抗癌药物的宝库,川芎嗪是从川芎中提取的一种生物碱单体,川芎嗪作为川芎的主要活性成分,多项研究证实川芎嗪可对肝癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌和乳腺癌等多种肿瘤具有良好的抗肿瘤作用。然而,关于川芎嗪是否能抑制结肠癌细胞生长及其作用机制的研究较少。目的探讨川芎嗪对结肠癌的抗肿瘤作用,并探讨其抗结肠癌的作用机制。川芎嗪对不同结肠癌细胞的杀伤作用分析;明确川芎嗪抗结肠癌细胞增殖以及促进结肠癌细胞凋亡的作用;进一步探讨川穹嗪改变线粒体活性氧代谢介导结肠癌细胞凋亡通路的调控机制;在结肠癌荷瘤小鼠中验证川芎嗪的抗肿瘤效果。方法采用结晶紫染色法观察川芎嗪对结肠癌细胞的杀伤作用;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞增殖率,观察川芎嗪作用的浓度依赖性和时间依赖性并计算IC50;通过流式细胞术检测细胞凋亡率及对细胞周期的影响;运用Annexin-V/PI双染的方法检测细胞凋亡的类型和比例;细胞内活性氧含量用DCFH-DA探针来检测;用活性氧抑制剂（NAC）和Caspase泛抑制剂（Z-VAD-FMK）联合川芎嗪作用于结肠癌细胞,观察清除活性氧及阻断凋亡相关靶蛋白后对结肠癌细胞凋亡的影响;建立结肠癌荷瘤动物模型,通过检测肿瘤组织中丙二醛和分析移植肿瘤内活性氧含量,采用Caspase 3和Caspase 9活性检测试剂盒检测移植肿瘤内Caspase 3和Caspase 9蛋白含量。结果1.川芎嗪对6种结肠癌细胞均有杀伤效果,并且随着川芎嗪药物浓度升高,结肠癌细胞存活量逐渐减少,杀伤效果在HCT116和SW480两株细胞中最为敏感。HCT116和SW480两种细胞系的IC50最低;2.随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长,显微镜下细胞数减少。与对照组相比,3.川芎嗪浓度达到600μg/ml时,HCT116和SW480细胞数目显着减少,细胞收缩和圆,分裂和漂浮。随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长,HCT116和SW480细胞的增殖活性逐渐降低;4.随着川芎嗪浓度的增加,G1期的细胞比例逐渐增多,S期的细胞比例逐渐减少。与对照组相比,在600μg/ml以上浓度的川芎嗪作用下,细胞周期中S期的比例与对照组相比差异有统计学意义;5.随着川芎嗪浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,呈浓度依赖性。600μg/ml处理组细胞凋亡率具有统计学意义。SW480细胞中以早期凋亡增加（annexin+/pi-,右下象限）增加为着,HCT116细胞呈现晚期凋亡（annexin+/pi+,右上象限）增加为着;6.与DMSO对照组相比,川芎嗪组的HCT116和SW480细胞数目显着减少,细胞收缩变圆、破碎并漂浮。川芎嗪+NAC和川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪组相比,细胞数目明显增多。川芎嗪组相比DMSO对照组细胞凋亡率明显升高,川芎嗪+NAC和川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪组相比,两组凋亡率显着降低。NAC组细胞存活率高于Z-VAD-FMK 组;7.川芎嗪组活性氧含量明显增加,与DMSO组相比有显着性差异。川芎嗪+NAC组与川芎嗪处理组相比,活性氧含量显着下降。川芎嗪+Z-VAD-FMK组活性氧含量与川芎嗪处理组在SW480结肠癌细胞中无明显变化。在HCT116结肠癌细胞中川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪处理组相比活性氧含量有所下降;8.川芎嗪组与对照组相比,Caspase 3,9和PARP均发生明显的剪切活化,蛋白表达明显增高。川芎嗪+Z-VAD-FMK组和川芎嗪+NAC组,与川芎嗪组相比,Caspase 3,9和PARP这种活化可以被Z-VAD-FMK和NAC显着抑制;川芎嗪+NAC组Caspase 3,9和PARP表达与川芎嗪+Z-VAD-FMK组相比,表达抑制更为显着,蛋白表达降低;9.动物实验中,高浓度川芎嗪组移植瘤生长明显抑制,且呈浓度依赖性,移植瘤的重量分布为:1.62±0.48 g（浓度 0 mg/kg）、0.92±0.21 g（浓度 50 mg/kg）和 0.58±0.19 g（浓度100 mg/kg）,差异有显着性和浓度依赖性;10.川芎嗪高浓度组（100 mg/kg）的动物模型移植肿瘤中的丙二醛和Caspase3,9蛋白含量显着高于低浓度组（50 mg/kg）和对照组（0 mg/kg）,具有显着统计学差异,且有浓度依赖性。结论1.川芎嗪对结肠癌细胞有明显的抑制增殖、促进凋亡作用,并呈现时间与浓度依赖性;2.结肠癌细胞在川芎嗪作用下能够将凋亡细胞增殖阻止在G1期,进而抑制细胞周期S期的合成,从而抑制细胞增殖;3.川芎嗪诱导结肠癌细胞凋亡与产生大量活性氧从而激活Caspase依赖性细胞凋亡通路密切相关,活性氧抑制剂可以更有效抑制川芎嗪诱导的细胞凋亡;4.川芎嗪诱导结肠癌细胞内活性氧含量增高在Caspase依赖性凋亡通路的上游发挥诱导细胞凋亡的调控作用;5.川芎嗪在结肠癌裸鼠移植瘤中能显着抑制肿瘤增殖,增加裸鼠体内的活性氧和Caspase3,9的含量并诱导肿瘤细胞凋亡。
马浩洁[8]（2021）在《基于L-OPA1探讨补阴牵正方调控线粒体动态平衡防治帕金森病的机制》文中研究说明研究背景帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种中老年群体常见且高发的神经退行性疾病,其主要病理改变是中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元的进行性丢失,由此诱发一系列严重影响患者生活质量的运动及非运动障碍症状。基于PD的病因病机学研究,学者提出PD的发生发展与线粒体动态平衡密切相关。线粒体分裂蛋白和线粒体融合蛋白可以调控线粒体动态平衡,进而影响线粒体的形态结构及功能。作为调控线粒体内膜融合的关键分子,视神经萎缩蛋白1（opticatrophy 1,OPA1）与PD的发生发展密切相关,但具体作用机制尚未完全清楚,需进行更深入的研究。目前临床上主要采用左旋多巴等药物对PD进行对症治疗,此类药物虽能改善PD症状,但有副反应多和疗效减退等弊端。中医药防治PD因具有毒副作用小、疗效稳定的优点,在临床广泛应用。其中,由古方大补阴丸和牵正散组合而成的补阴牵正方（Bu-Yin-Qian-Zheng-Fang,BYQZF）具有滋补肝肾、祛风化痰、通络止痉等功效,是临床治疗PD的常用方剂。已有的初步研究表明,BYQZF不仅能够改善PD细胞模型中线粒体的形态结构和功能,而且能够调控OPA1的表达。但是,BYQZF的这种改善作用与OPA1的关系及BYQZF调控OPA1表达的作用机制尚不清楚。本研究从维持线粒体动态平衡的关键分子OPA1的亚基L-OPA1入手,构建L-OPA1过表达及敲减的PD细胞模型,揭示L-OPA1改善PD细胞模型线粒体形态结构和功能的作用机制;阐释BYQZF通过L-OPA1维持线粒体质量的分子机制;进一步说明BYQZF对PD模型GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的影响,阐明BYQZF防治PD的作用靶标和环节。为临床应用BYQZF治疗PD提供实验依据,并为深入阐释线粒体与中医“阴阳”及“肝肾阴虚”证候的相关性提供科学内涵。研究目的1.以维持线粒体动态平衡的相关分子为切入点,从PD细胞水平揭示BYQZF对线粒体形态结构和功能的影响及机制,阐明该方通过GSK3β/OMA1/L-OPA1通路保护PD细胞线粒体的作用环节。2.以维持线粒体动态平衡的关键分子L-OPA1为切入点,揭示融合蛋白L-OPA1对PD细胞模型线粒体形态和功能的改善作用,阐明BYQZF对PD细胞线粒体形态和功能的改善作用与L-OPA1的相关性。3.探讨BYQZF对PD动物模型脑GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的调控作用,进一步揭示BYQZF调节L-OPA1维持线粒体动态平衡的途径。研究方法第一章BYQZF对PD细胞模型线粒体形态结构和功能的影响:选用SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型,中药BYQZF干预,CCK-8法检测各组细胞存活率;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;透射电镜观察各组SH-SY5Y细胞超微结构变化;采用线粒体探针,激光共聚焦扫描显微镜观察细胞线粒体的形态;应用荧光素酶法检测线粒体ATP水平及ADP/ATP比率;JC-1法检测线粒体膜电位;流式细胞仪检测线粒体ROS水平;Western Blot技术检测细胞CytC蛋白的表达。第二章BYQZF对PD细胞模型线粒体分裂融合蛋白的影响及作用机制:在第一章的基础上,采用Western Blot技术检测线粒体分裂蛋白DRP1、FIS1、MFF,线粒体融合蛋白MFN1、MFN2、L-OPA1及OMA1和GSK3β蛋白的表达;采用免疫荧光双标技术观察分裂蛋白DRP1和TOM20、DRP1和FIS1、DRP1和MFF、融合蛋白MFN1和TOM20、MFN2和TOM20、OPA1和COXIV的表达和共定位水平。第三章BYQZF对L-OPA1调控PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:构建L-OPA1过表达/敲减质粒并用脂质体介导法转染SH-SY5Y细胞,Western Blot技术及qPCR技术鉴定L-OPA1过表达/敲减水平。在此基础上进行MPP+造模及BYQZF的干预,检测细胞存活率和凋亡率、线粒体形态、ATP水平、ADP/ATP 比率、线粒体膜电位、ROS水平及Cyt C蛋白的表达水平,方法同第一章。第四章BYQZF对L-OPA1调控PD细胞模型线粒体分裂融合蛋白的影响:基于第三组的分组和干预,进一步检测DRP1、FIS1、MFF及MFN1、MFN2、L-OPA1蛋白的表达水平,方法同第二章;观察DRP1与TOM20、DRP1与FIS1、DRP1与MFF、MFN1与TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COXIV的表达和共定位水平,方法同第二章。第五章BYQZF对PD动物模型脑GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的影响:选用MPTP构建PD小鼠模型,中药BYQZF的干预,免疫荧光技术观察中脑黑质TH 阳性神经元的表达;透射电镜观察各组小鼠中脑黑质DA神经元的超微结构;JC-1法检测PD动物脑线粒体膜电位水平;Western Blot技术检测各组小鼠脑内DRP1、FIS1、MFF及MFN1、MFN2、L-OPA1、OMA1和GSK3β蛋白的表达水平;免疫荧光双标技术检测各组小鼠中脑黑质 DRP1 与 TOM20、DRP1 与 FIS1、DRP1 与 MFF、MFN1 与 TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COX IV的表达和共定位水平。研究结果1.第一章结果:BYQZF可显着改善PD细胞模型线粒体形态结构和功能的损伤。可抑制细胞凋亡,增加细胞存活率,增加线粒体活性、长宽比及网络分支数、ATP水平及线粒体膜电位,降低ADP/ATP 比率、ROS及CytC的水平。2.第二章结果:BYQZF可显着提高PD细胞模型MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达;降低DRP1、FIS1和MFF及GSK3β、OMA1蛋白的表达;增加MFN1与TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COX IV的共定位水平;降低DRP1与TOM20、DRP1与FIS1、DRP1与MFF的共定位水平。3.第三章结果:相较于L-OPA1过表达模型组,L-OPA1过表达中药组的线粒体活性、线粒体形态因子、长宽比及网络分支数增多、ATP水平和线粒体膜电位升高,ADP/ATP比率、ROS及CytC的水平下降;细胞存活率升高,凋亡率下降。相较于空载中药组,L-OPA1过表达中药组的细胞存活率升高,凋亡率下降。相较于L-OPA1敲减模型组,L-OPA1敲减中药组的线粒体形态因子、线粒体膜电位升高,ADP/ATP 比率及CytC的水平下降,细胞存活率升高。相较于空载中药组,L-OPA1敲减中药组的细胞存活率、线粒体活性、线粒体形态因子、长宽比及网络分支数增多、ATP水平和线粒体膜电位显着降低,ADP/ATP比率、ROS及CytC的水平及凋亡率显着升高。4.第四章结果:相较于空载中药组及L-OPA1过表达模型组,L-OPA1过表达中药组的MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达显着升高,DRP1、FIS1和MFF蛋白的表达显着下降;且融合蛋白与线粒体的共定位增多,分裂蛋白与线粒体的共定位减少。相较于空载模型组,L-OPA1敲减中药组的DRP1、FIS1蛋白的表达及与线粒体上的共定位显着下降,但融合蛋白无显着改变;相较于空载中药组,L-OPA1敲减中药组的MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达显着降低,DRP1、FIS1和MFF蛋白的表达显着升高;且融合蛋白与线粒体的共定位减少,分裂蛋白与线粒体的共定位增加。5.第五章结果:BYQZF可显着改善PD小鼠黑质TH阳性神经元数量的减少、超微结构的损伤;提高脑线粒体膜电位水平;增加PD小鼠脑MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达;降低DRP1、FIS1和MFF及GSK3β、OMA1蛋白的表达;增加PD小鼠黑质MFN1与TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COX IV的共定位水平;降低DRP1与TOM20、DRP1与FIS1、DRP1与MFF的共定位水平。结论1.BYQZF对PD模型线粒体动态平衡的调控与L-OPA1密切相关,可通过增加线粒体融合蛋白的表达及与线粒体的共定位水平,减少线粒体分裂蛋白的表达及与线粒体的共定位水平,改善线粒体形态结构和功能的损伤,发挥保护DA神经元的作用。阐释了具有滋补肝肾（治本）、祛风化痰、通络止痉（治标）功效的BYQZF防治PD的分子生物学机制可能与L-OPA1调控线粒体分裂融合的“阴阳”平衡,减轻肝肾亏虚引发的线粒体损伤有关。2.BYQZF维持线粒体动态平衡保护DA神经元的作用环节,可能与通过抑制GSK3β和OMA1的表达,进而减少L-OPA1的水解,改善PD细胞和动物模型线粒体形态结构和功能的损伤有关。
陈婷婷[9]（2021）在《丹参酮Ⅰ通过BNIP3/NIX介导的线粒体自噬和代谢重编程抑制宫颈癌转移机制的研究》文中研究表明研究目的:宫颈癌是女性下生殖道最常见的恶性肿瘤,恶性程度高、发病率和术后复发率高。丹参是活血化瘀的常用中药,丹参酮Ⅰ是其重要的脂溶性成分之一,课题组前期研究结果发现丹参酮Ⅰ对宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移具有抑制作用,并能直接影响线粒体超微结构,然而,其具体机制尚不明确,因此本文主要聚焦线粒体功能,研究丹参酮Ⅰ对宫颈癌细胞增殖,迁移和线粒体能量代谢的作用及机制。阐明丹参酮Ⅰ诱导宫颈癌细胞线粒体自噬并影响代谢重编程,最终抑制宫颈癌细胞转移机制。研究内容与方法:通过CCK-8、细胞计数、集落实验和Transwell小室实验观察丹参酮Ⅰ对宫颈癌SiHa细胞增殖、数量、集落形成能力以及细胞迁移和侵袭能力的影响;通过Annexin V-FITC/PI和PI/RNase染色实验检测丹参酮Ⅰ对宫颈癌HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响;通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜实验观察丹参酮Ⅰ对宫颈癌HeLa细胞自噬标志物以及自噬流的影响;通过流式细胞术、倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜实验分别检测丹参酮Ⅰ对HeLa细胞线粒体膜电位、线粒体数量以及线粒体与溶酶体共定位的影响;通过分子对接技术检测丹参酮Ⅰ与BNIP3/NIX相互作用的模式;通过RNA测序和1HNMR代谢组学实验检测丹参酮Ⅰ对宫颈癌HeLa细胞差异基因表达谱和代谢产物的影响;最后通过Western Blot实验验证丹参酮Ⅰ对宫颈癌HeLa细胞BNIP3/NIX线粒体自噬通路的影响。研究结果:与对照组相比,12.5-50μM的丹参酮Ⅰ显着抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力,减少细胞数量,抑制细胞集落形成以及迁移与侵袭能力,并且呈浓度和时间依赖性。浓度为12.5-25μM的丹参酮Ⅰ显着诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡和细胞周期S期阻滞,尤其在药物作用48h后,最高浓度50μM的丹参酮Ⅰ无明显作用。而50μM的丹参酮Ⅰ可显着诱导细胞自噬标志物LC3B的表达以及自噬流的产生,且加入氯喹后自噬现象被阻断。此外,50μM丹参酮Ⅰ显着降低HeLa细胞膜电位、破坏F-actin结构、增加线粒体数量和促进线粒体与溶酶体的共定位（线粒体自噬）。分子对接结果显示丹参酮Ⅰ能通过氢键与BNIP3/NIX相互作用。进一步机制研究表明:50μM丹参酮Ⅰ显着影响宫颈癌细胞RNA表达谱;KEGG分析表明其主要影响“癌症中心碳代谢”和“线粒体自噬-动物”等生物过程。代谢组学结果显示50μM丹参酮Ⅰ显着影响HeLa细胞的25种代谢产物,如谷氨酸、缬氨酸、ATP和NAD等;KEGG通路富集结果提示其能影响细胞代谢过程包括蛋白质的消化与吸收代谢、能量代谢、氨基酸代谢等。丹参酮Ⅰ显着促进线粒体自噬相关蛋白BNIP3、NIX和Optineurin的表达,同时促进LC3I向LC3Ⅱ的转化,抑制NDP52和P62的表达;加入氯喹后,LC3I向LC3Ⅱ的转化进一步增加,P62蛋白表达增加。结论:（1）丹参酮Ⅰ显着抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且呈药物浓度和作用时间依赖性;（2）丹参酮Ⅰ诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡和细胞周期S期阻滞;（3）丹参酮Ⅰ诱导宫颈癌HeLa细胞线粒体自噬和线粒体功能障碍;（4）丹参酮Ⅰ通过氢键与BNIP3/NIX相互作用,并且显着影响宫颈癌HeLa细胞的差异表达基因谱和代谢重编程;（5）丹参酮Ⅰ促进线粒体自噬相关蛋白BNIP3、NIX、和Optineurin的表达,促进LC3I向LC3Ⅱ的转化,抑制NDP52和P62的表达;
严俊芳[10]（2021）在《电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究》文中指出肺癌作为全球第一大癌症,是威胁人类健康的凶险癌症类型。放射治疗作为疗效明确的肺癌治疗手段,被应用于肺癌治疗的各个阶段。放射治疗的辐射效应主要引起核基因组的损伤和细胞质损伤比如线粒体功能紊乱。重离子治癌作为先进的放射治疗手段,因其独特的物理优势,能诱发显着的生物学效应,明显提高肺癌病人的治愈率,但其机理仍不清楚。本文以非小细胞肺癌为研究对象,首先探究了X射线和碳离子以及两者联合博来霉素诱导的复杂DNA损伤的动态应答机制。其次,围绕碳离子单独或协同替加环素诱导线粒体功能紊乱展开研究,并对DNA损伤应答与线粒体功能紊乱的相互作用机制做了初步探究,重点阐述重离子治癌的生物学效应机理,使其治癌优势发挥更大。首先,本文对比X射线发现肺癌细胞对碳离子辐照更加敏感,且碳离子诱导的复杂DSB损伤频率较X射线增加。两种射线联合博来霉素后复杂DSB损伤频率为X射线<X射线联合博来霉素<碳离子<碳离子联合博来霉素。随着损伤频率的增加,识别因子γH2AX和53BP1更难募集到损伤位点,募集出现滞后现象。通过修复蛋白的差异表达分析发现,除X射线辐照外,其余各组非同源末端连接（NHEJ）修复因子Ku70的表达上调,而同源重组（HR）修复因子Rad51表达没有显着性差异,表明复杂DSB损伤修复可能以NHEJ为主。碳离子组和碳离子联合博来霉素组中单链损伤识别蛋白XRCC1的表达均下调,说明DNA单链断裂（SSB）逐渐被修复。下一步,对比抗肿瘤药物替加环素发现碳离子、替加环素及两者联合能够抑制A549和H1299细胞增殖并诱导线粒体功能紊乱,且联合作用诱导的毒性作用和线粒体功能紊乱最显着。线粒体功能紊乱体现在ATP产生降低,线粒体膜电势降低和线粒体Ca2+摄入量增加。在A549细胞中,碳离子、替加环素及两者联合作用诱导细胞凋亡。而在H1299细胞中,碳离子及两者联合作用诱导凋亡和自噬水平增加。在分子水平上,对比于替加环素的应答通路AMPK/mTOR,碳离子及联合作用通过Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白影响线粒体翻译,从而调控线粒体功能,且P53缺陷株H1299细胞对线粒体翻译抑制敏感。最后,初步探究发现ATM/p53/mTOR信号通路是DNA损伤和线粒体功能紊乱的共同调控通路。ATM抑制增加了A549细胞对碳离子的辐射敏感性,主要表现在ATM抑制能够下调碳离子辐照后DSB修复因子Ku70和γH2AX的表达,降低DNA损伤修复能力,同时增加线粒体对Ca2+的摄取,导致线粒体功能紊乱。另外,抑制ATM能够降低辐照后p53磷酸化水平,增加mTOR的磷酸化。进一步发现p53磷酸化抑制后可通过降低AMPK磷酸化水平和激活Akt,从而上调mTOR活性。以上结果表明ATM不仅参与DSB修复,还可通过p53调控mTOR通路,进而调控线粒体功能。碳离子辐照24小时后,LC3-II/I比值发生下调,caspase-3活性增加,ATM抑制则能够下调LC3-II/I比值。因此,自噬水平的降低和细胞凋亡的增加共同决定了细胞的命运,ATM抑制则加重了这一现象。综上所述,本研究对比了X射线和重离子诱导的DNA损伤识别修复的动态应答过程,同时为重离子诱导线粒体功能紊乱提供了新的见解。最后,探究了DNA损伤修复和线粒体功能紊乱的的共同调控机制,连接了碳离子辐射后细胞核和线粒体的直接的双向信号,为重离子治癌提供了直接的生物学依据。
二、线粒体与细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、线粒体与细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）骨关节炎与线粒体异常（论文提纲范文）
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.1.1 检索人及检索时间 |
| 1.1.2 检索数据库 |
| 1.1.3 检索词 |
| 1.1.4 检索文献类型 |
| 1.1.5 检索文献时限 |
| 1.1.6 检索策略P |
| 1.1.7 检索文献量 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.2.1 纳入标准 |
| 1.2.2 排除标准(1)摘要、会议论文、报刊文章等常规一次性文 |
| 1.3 文献质量评估 |
| 2 结果Results |
| 2.1 骨关节炎与线粒体研究的时间脉络 |
| 2.2 骨关节炎与线粒体氧化还原 |
| 2.3 骨关节炎与线粒体的生物发生 |
| 2.4 骨关节炎与线粒体动力学 |
| 2.5 骨关节炎与线粒体有丝分裂 |
| 2.6 骨关节炎与线粒体遗传学 |
| 2.7 骨关节炎时线粒体钙的调节 |
| 2.8 通过线粒体途径治疗骨关节炎的总结 |
| 2.8.1 内源性分子靶点恢复线粒体功能 |
| 2.8.2 外源性药物优化线粒体功能 |
| 3 讨论Discussion |
| 3.1 既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题 |
| 3.2 作者综述区别于他人他篇的特点 |
| 3.3 综述的局限性 |
| 3.4 综述的重要意义 |
（2）煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一. 研究背景与意义 |
| 二. 国内外煤尘致病现状与存在问题 |
| 1. 煤尘致呼吸系统疾病现状 |
| 2. 煤尘暴露与肺癌 |
| 3. 煤尘致病机制研究进展 |
| 4. 煤尘致肺组织的遗传物质不稳定 |
| 三. 研究内容、技术路线及研究意义 |
| 1. 主要研究内容 |
| 2. 研究的技术路线 |
| 3. 主要研究意义 |
| 四. 参考文献 |
| 第一部分 煤尘暴露与肺癌风险的Meta分析 |
| 一. 材料与方法 |
| 1. 文献检索 |
| 2. 文献筛选与数据提取 |
| 3. 文献质量评价 |
| 4. 统计学分析 |
| 二. 结果 |
| 1. 文献纳入结果 |
| 2. 纳入研究的基本信息与质量评价 |
| 3. 综合分析 |
| 4. 敏感度分析和发表偏倚评价 |
| 5. 亚组分析 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 五. 参考文献 |
| 第二部分: 煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应研究 |
| 一. 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二. 结果 |
| 1. 煤尘的理化性质 |
| 2. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞形态学异常 |
| 3. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞增殖活力、迁移及DNA修复能力显着增强 |
| 4. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞基因组不稳定 |
| 5. 煤尘暴露致BEAS-2B~(CD)细胞内病理性信号通路显着上调 |
| 6. 煤尘暴露赋予BEAS-2B~(CD)细胞体内成瘤潜能 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 五. 参考文献 |
| 第三部分 煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化机制研究 |
| 一. 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二. 结果 |
| 1. 煤尘暴露BEAS-2B细胞触发线粒体损伤 |
| 2. 线粒体损伤诱导DNA断裂 |
| 3. DNA断裂激活HR/NHEJ修复酶及其相关联的AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路 |
| 4. AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路增强BEAS-2B~(CD)细胞增殖活力、迁移能力并激活原癌基因转录因子 |
| 5. 抑制AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路降低BEAS-2B~(CD)细胞增殖活力、周期进展、迁移能力并促进细胞凋亡 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 五. 参考文献 |
| 结论 |
| 主要创新点 |
| 综述 线粒体功能异常与肿瘤的发生与发展 |
| 1. 线粒体代谢与肿瘤 |
| 2. 线粒体动力学与肿瘤 |
| 3. 线粒体凋亡与肿瘤 |
| 4. 线粒体基因组不稳定与肿瘤 |
| 5. 线粒体ROS与肿瘤 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
（3）紫丁香苷的提取分离工艺优化及对HGC-27细胞增殖抑制作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 天然抗肿瘤药物研究现状 |
| 1.2 刺五加研究进展 |
| 1.2.1 药用植物刺五加的资源现状 |
| 1.2.2 刺五加有效化学成分研究进展 |
| 1.2.3 刺五加药理作用研究进展 |
| 1.2.4 刺五加的临床应用 |
| 1.2.5 刺五加质量控制的成分研究现状 |
| 1.2.6 刺五加中有效成分提取与纯化方法的研究现状 |
| 1.3 网络药理学在中药及复方研究中的应用 |
| 1.3.1 复方中药配伍研究 |
| 1.3.2 中药及中药复方活性成分研究 |
| 1.3.3 预测中药及复方新的适应症 |
| 1.3.4 阐释中药及复方的作用机制 |
| 1.4 免疫组织化学法研究概述 |
| 1.5 细胞凋亡信号通路研究现状 |
| 1.5.1 胱天蛋白酶途径 |
| 1.5.2 线粒体途径 |
| 1.5.3 死亡受体途径 |
| 1.5.4 内质网途径 |
| 1.6 课题来源及意义 |
| 1.6.1 课题来源 |
| 1.6.2 研究目的及意义 |
| 1.7 论文研究内容 |
| 1.7.1 紫丁香苷的提取、分离及鉴定 |
| 1.7.2 紫丁香苷对肿瘤细胞活性影响 |
| 1.7.3 网络药理学预测紫丁香苷抗肿瘤作用机制 |
| 1.7.4 紫丁香苷抗肿瘤作用机制研究 |
| 2 紫丁香苷的提取、分离及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 试验药品及试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 紫丁香苷提取工艺优化 |
| 2.3.2 紫丁香苷的提取分离 |
| 2.3.3 紫丁香苷MS结构鉴定 |
| 2.3.4 紫丁香苷纯度检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 紫丁香苷提取工艺优化结果 |
| 2.4.2 紫丁香苷提取分离 |
| 2.4.3 紫丁香苷结构鉴定 |
| 2.4.4 紫丁香苷纯度 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 紫丁香苷对HGC-27细胞活性影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.2.1 实验细胞株 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验药品及试剂 |
| 3.2.4 试剂配置 |
| 3.2.5 细胞传代培养 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MTT法检测紫丁香苷对HGC-27增殖抑制作用 |
| 3.3.2 HE染色检测紫丁香苷对HGC-27细胞活性的影响 |
| 3.3.3 细胞克隆形成实验检测紫丁香苷对HGC-27细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MTT法检测紫丁香苷对HGC-27增殖抑制作用 |
| 3.4.2 HE染色检测紫丁香苷对HGC-27细胞活性的影响 |
| 3.4.3 细胞克隆形成实验检测紫丁香苷对HGC-27细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 网络药理学预测紫丁香苷抗肿瘤作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 预测紫丁香苷作用靶点 |
| 4.2.2 预测胃癌相关靶点蛋白 |
| 4.2.3 构建“紫丁香苷-抗胃癌作用靶点”网络 |
| 4.2.4 构建蛋白质相互作用网络(protein-proteininteraction,PPI) |
| 4.2.5 生物过程与通路分析 |
| 4.3 预测结果 |
| 4.3.1 紫丁香苷与胃癌疾病相关靶点搜集 |
| 4.3.2 “紫丁香苷-抗胃癌作用靶点”网络构建 |
| 4.3.3 PPI网络分析 |
| 4.3.4 GO功能富集分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 紫丁香苷对HGC-27细胞增殖抑制作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器及试剂 |
| 5.2.1 实验细胞株 |
| 5.2.2 实验药品及试剂 |
| 5.2.3 试剂配制 |
| 5.2.4 细胞传代培养 |
| 5.3 实验内容及方法 |
| 5.3.1 PI单染法检测紫丁香苷诱导HGC-27凋亡 |
| 5.3.2 免疫组化法检测紫丁香苷对HGC-27细胞中Bax和Bcl-2蛋白的影响 |
| 5.3.3 PI单染色法检测紫丁香苷对HGC-27细胞周期的影响 |
| 5.3.4 统计学处理 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 紫丁香苷诱导HGC-27凋亡 |
| 5.4.2 紫丁香苷对Bax蛋白表达的影响 |
| 5.4.3 紫丁香苷对BCL-2蛋白表达的影响 |
| 5.4.4 紫丁香苷对HGC-27细胞周期的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）健脾祛湿和络方上调线粒体自噬减少被动Heymann肾炎大鼠足细胞调亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一、线粒体功能障碍与肾小球足细胞损伤 |
| 1 线粒体的生物学功能 |
| 2 线粒途径介导的足细胞损伤 |
| 3 足细胞相关的线粒体自噬信号通路 |
| 4 展望 |
| 5 参考文献 |
| 综述二、特发性膜性肾病的中医药治疗及研究进展 |
| 1 特发性膜性肾病的中医概念 |
| 2 特发性膜性肾病的辨治思路 |
| 3 中医药治疗特发性膜性肾病的临床研究 |
| 4 基于足细胞损伤中药治疗特发性膜性肾病的机制研究 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 健脾祛湿和络方对被动Heymann大鼠的肾脏保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 指标留取 |
| 4 检测指标及方法 |
| 5 统计方法 |
| 结果 |
| 1 大鼠一般情况比较 |
| 2 生化指标比较 |
| 3 肾组织病理形态比较 |
| 讨论 |
| 1 实验动物模型的选择与鉴定 |
| 2 健脾祛湿和络方的组方依据 |
| 3 健脾祛湿和络方的肾脏保护作用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 健脾祛湿和络方对被动Heymann肾炎大鼠线粒体功能障碍及足细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 指标留取 |
| 4 检测指标及方法 |
| 5 统计方法 |
| 结果 |
| 1 线粒体损伤情况比较 |
| 2 肾小管、肾小球细胞凋亡率比较 |
| 3 足细胞损伤及凋亡情况比较 |
| 讨论 |
| 1 被动Heymann肾炎大鼠存在足细胞线粒体功能障碍 |
| 2 健脾祛湿和络方对线粒体及足细胞凋亡的影响 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 健脾祛湿和络方对PINK1/Parkin介导线粒体自噬通路的调控作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 指标留取 |
| 4 检测指标及方法 |
| 5 统计方法 |
| 结果 |
| 1 各组足细胞线粒体自噬相关蛋白荧光共定位情况的比较 |
| 2 Western bolt检测PINK1/Parkin通路相关自噬蛋白表达 |
| 3 Western bolt检测凋亡相关的线粒体蛋白 |
| 讨论 |
| 1 健脾祛湿和络方对PINK1/Parkin线粒体自噬信号通路的调控 |
| 2 健脾祛湿和络方上调线粒体自噬减少足细胞凋亡 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在校期间的主要研究成果 |
| 中医药科技查新报告书 |
（5）Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词汇 |
| 前言 |
| 第一部分 Peroxiredoxin Ⅴ通过ROS/Bcl2信号通路抑制大黄素诱导的胃癌细胞凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料与实验仪器 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏、换液 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞冻存 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.2.2 AGS胃癌细胞侵染 |
| 1.2.2.3 AGS胃癌转染细胞的筛选 |
| 1.2.3 细胞内ROS检测 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 蛋白质免疫印迹法 |
| 2.结果 |
| 2.1 大黄素对胃癌细胞内活性氧水平的影响 |
| 2.2 大黄素诱导AGS胃癌细胞凋亡,降低Prx Ⅴ表达水平 |
| 2.2.1 荧光显微镜检测结果 |
| 2.2.2 流式细胞仪检测结果 |
| 2.2.3 Emodin对 AGS细胞内Prxs家族某些蛋白表达水平的影响 |
| 2.3 大黄素诱导的AGS细胞凋亡与细胞内ROS相关 |
| 2.3.1 抑制活性氧后细胞内凋亡水平 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测细胞内ROS水平 |
| 2.4 过表达Prx Ⅴ可减少大黄素诱导的AGS细胞凋亡 |
| 2.4.1 慢病毒载体构建Prx Ⅴ敲降、过表达以及空白载体AGS细胞系 |
| 2.4.2 不同浓度大黄素对AGS细胞的影响 |
| 2.4.3 大黄素时间段处理AGS细胞 |
| 2.5 过表达Prx Ⅴ可显着调节大黄素处理AGS细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 2.5.1 蛋白免疫印迹法检测Mock/shPrx Ⅴ/Prx Ⅴ-his的AGS细胞中Bad、cleaved-PARP和Bcl2的表达水平 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 沉默Peroxiredoxin Ⅴ基因提高阿霉素诱导的胃癌细胞线粒体依赖性凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料与实验仪器 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞换液 |
| 1.2.1.3 细胞传代 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.2.1 慢病毒构建 |
| 1.2.2.2 慢病毒侵染 |
| 1.2.2.3 转染细胞的筛选 |
| 1.2.3 细胞内ROS检测 |
| 1.2.3.1 DHE荧光探针检测细胞内活性氧的变化 |
| 1.2.3.2 MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内活性氧的变化 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 细胞线粒体膜电位检测 |
| 1.2.6 蛋白质免疫印迹法 |
| 1.2.6.1 回收AGS细胞蛋白质样品 |
| 1.2.6.2 检测蛋白质浓度 |
| 1.2.6.3 进行凝胶电泳分离蛋白 |
| 1.2.6.4 脱脂乳进行封闭及一抗,二抗封闭 |
| 1.2.6.5 Western blot成像仪进行照相 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素对AGS细胞的细胞毒性作用 |
| 2.1.1 蛋白质免疫印迹法检测结果 |
| 2.1.2 MTT检测结果 |
| 2.2 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞凋亡及活性氧蓄积 |
| 2.2.1 荧光显微镜、流式细胞术分析结果 |
| 2.2.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.3 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞线粒体膜通透性、线粒体依赖性凋亡及活性氧 |
| 2.3.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.3.2 荧光染色检测结果 |
| 2.4 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞线粒体膜通透性、线粒体依赖性凋亡及活性氧 |
| 2.4.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.5 活性氧是Prx Ⅴ发挥作用的主要靶点之一 |
| 2.5.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.5.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.6 活性氧是Prx Ⅴ发挥作用的主要靶点之一 |
| 2.6.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.6.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.7 活性氧清除剂有效抑制因沉默Prx Ⅴ引发的细胞凋亡 |
| 2.7.1 蛋白质免疫印迹法分析结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录攻读学位期间发表的论文 |
（6）血根碱对线粒体自噬的抑制作用及其毒性作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血根碱简介 |
| 1.1.1 血根碱的化学性质 |
| 1.1.2 血根碱的研究现状 |
| 1.2 线粒体自噬 |
| 1.2.1 线粒体自噬的功能作用 |
| 1.2.2 细胞自噬及线粒体自噬的研究历程 |
| 1.2.3 线粒体自噬失调导致的相关疾病 |
| 1.3 斑马鱼简介 |
| 第2章 血根碱通过PINK1/Parkin通路抑制线粒体自噬 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液配制 |
| 2.3.2 实验分组以及细胞处理 |
| 2.3.3 PINK1/Parkin荧光成像 |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SAN抑制了CCCP诱导的线粒体自噬 |
| 2.4.2 SAN通过PINK1/Parkin通路抑制线粒体自噬 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 血根碱导致PC12 神经细胞凋亡并诱发斑马鱼神经损伤的发生 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物和细胞 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 溶液配制 |
| 3.3.2 实验分组及处理 |
| 3.3.3 多巴胺神经元检测 |
| 3.3.4 脑部血管系统发育检测 |
| 3.3.5 斑马鱼TUNEL凋亡染色 |
| 3.3.6 行为学检测 |
| 3.3.7 RNA提取及real-time PCR |
| 3.3.8 Hoechst33342-PI双染凋亡成像检测 |
| 3.3.9 Ed U增殖成像检测 |
| 3.3.10 ROS活性氧成像检测 |
| 3.3.11 Western blot |
| 3.3.12 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 血根碱对斑马鱼多巴胺神经元发育的影响 |
| 3.4.2 血根碱对斑马鱼脑部血管发育的影响 |
| 3.4.3 血根碱对斑马鱼行为学的影响 |
| 3.4.4 血根碱对斑马鱼线粒体自噬和神经损伤相关基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 血根碱对斑马鱼脑部凋亡水平影响 |
| 3.4.6 血根碱对PC12 神经细胞凋亡的影响 |
| 3.4.7 血根碱对PC12 神经细胞增殖的影响 |
| 3.4.8 血根碱对PC12 神经细胞ROS活性氧水平的影响 |
| 3.4.9 血根碱对PC12 神经细胞线粒体自噬和神经损伤相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 血根碱诱发斑马鱼心脏毒性并导致HL-1 心肌细胞凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物和细胞 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶液配制 |
| 4.3.2 实验分组及处理 |
| 4.3.3 斑马鱼胚胎发育检测 |
| 4.3.4 斑马鱼心脏毒性检测 |
| 4.3.5 斑马鱼组织病理学分析 |
| 4.3.6 斑马血细胞染色(邻联茴香胺染色法) |
| 4.3.7 斑马鱼吖啶橙凋亡染色 |
| 4.3.8 斑马鱼TUNEL凋亡染色 |
| 4.3.9 斑马鱼肠下静脉(SIVs)发育检测 |
| 4.3.10 斑马鱼动脉、静脉血流速度检测 |
| 4.3.11 RNA提取及real-time PCR |
| 4.3.12 HL-1 心肌细胞Hoechst33342-PI双染凋亡成像检测 |
| 4.3.13 HL-1 心肌细胞Ed U增殖成像检测 |
| 4.3.14 HL-1 心肌细胞ROS活性氧成像检测 |
| 4.3.15 Western blot |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SAN引起斑马鱼心脏毒性 |
| 4.4.2 SAN对斑马鱼心脏形态发育的影响 |
| 4.4.3 SAN对斑马鱼心脏容血、回血能力的影响 |
| 4.4.4 SAN对斑马鱼体内凋亡水平的影响 |
| 4.4.5 SAN对斑马鱼肠下静脉(SIVs)发育的影响 |
| 4.4.6 SAN对斑马鱼动脉、静脉血流速度的影响 |
| 4.4.7 SAN对斑马鱼体内心脏发育、凋亡、造血相关基因表达水平的影响 |
| 4.4.8 SAN对HL-1 心肌细胞凋亡的影响 |
| 4.4.9 SAN对HL-1 心肌细胞增殖的影响 |
| 4.4.10 SAN对 HL-1 心肌细胞ROS活性氧水平的影响 |
| 4.4.11 SAN对 HL-1 心肌细胞凋亡和MAPK信号通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 血根碱通过调节氧化应激、凋亡以及Wnt和 Nrf2 信号通路诱导斑马鱼幼鱼的发育毒性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 溶液配制 |
| 5.3.2 实验分组及处理 |
| 5.3.3 发育毒性、死亡率、畸形率、孵化率检测 |
| 5.3.4 心脏发育毒性 |
| 5.3.5 肝脏发育毒性 |
| 5.3.6 行为学变化和神经发育毒性 |
| 5.3.7 T-SOD、CAT、MDA水平检测 |
| 5.3.8 斑马鱼ROS活性氧检测 |
| 5.3.9 吖啶橙染色 |
| 5.3.10 TUNEL染色 |
| 5.3.11 RNA提取及real-time PCR |
| 5.3.12 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 SAN对斑马鱼发育毒性、死亡率、畸形率、孵化率的影响 |
| 5.4.2 SAN处理导致了斑马鱼的心脏毒性 |
| 5.4.3 SAN对斑马鱼的肝脏发育毒性 |
| 5.4.4 SAN处理导致了斑马鱼的神经发育毒性和行为学异常 |
| 5.4.5 SAN处理导致了斑马鱼体内ROS活性氧水平的升高以及T-SOD、CAT、MDA活性变化 |
| 5.4.6 SAN处理导致了斑马鱼的凋亡水平上升 |
| 5.4.7 SAN处理对斑马鱼Wnt、Nrf2 信号通路和凋亡、线粒体自噬相关基因表达水平的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要科研成果 |
| 一、发表学术论文 |
| 二、参与项目 |
| 三、参加会议 |
| 四、获得奖励 |
（7）川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 中医对结直肠癌病因病机及治疗的认识 |
| 1. 引言 |
| 2. 病症名称的历史沿革 |
| 3. 结直肠癌病因病机 |
| 4. 结直肠癌中医证候研究现状 |
| 5. 结直肠癌中医药治疗 |
| 6. 单味中药及其主要成分治疗结直肠癌的实验研究 |
| 7. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 川芎研究概述 |
| 1. 引言 |
| 2. 川芎的历史沿革 |
| 3. 川芎的功效与应用 |
| 4. 川芎主要有效成分川芎嗪的药理作用及临床外科应用 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 川芎嗪在消化系统肿瘤中的抗癌机制研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3. 促进肿瘤细胞凋亡和自噬 |
| 4. 诱导肿瘤细胞活性氧的生成 |
| 5. 抑制肿瘤细胞侵袭与转移 |
| 6. 抑制肿瘤组织血管生成 |
| 7. 逆转肿瘤细胞多药耐药 |
| 8. 展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 活性氧信号通路与肿瘤的研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. ROS的来源与调节 |
| 2.1 ROS的来源 |
| 2.2 ROS的调节 |
| 3. ROS相关信号通路 |
| 3.1 ROS促进细胞增殖 |
| 3.2 DNA损伤和遗传不稳定 |
| 3.3 适应性 |
| 3.4 细胞死亡 |
| 3.5 自噬 |
| 3.6 抗药性 |
| 4. ROS在肿瘤治疗中的作用 |
| 4.1 诱导肿瘤细胞死亡 |
| 4.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 川芎嗪对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞形态学实验 |
| 2.3 结晶紫染色测定细胞活性 |
| 2.4 CCK-8法检测细胞增殖 |
| 2.5 细胞周期检测 |
| 2.6 Annexin V/PI凋亡检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 TMP显着抑制结肠癌细胞增殖 |
| 3.2 TMP对结肠癌细胞的抑制作用具有浓度和时间依赖性 |
| 3.3 TMP通过抑制结肠癌细胞周期S期合成抑制细胞增殖 |
| 3.4 TMP诱导结肠癌细胞发生凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 活性氧对川芎嗪诱导的结肠癌细胞凋亡的调控机制研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 DCFH-DA探针细胞内ROS检测 |
| 2.2 蛋白印迹实验（Western blot) |
| 2.3 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TMP通过促进细胞内ROS产生来诱导结肠癌细胞发生凋亡 |
| 3.2 使用DCFH-DA探针检测结肠癌细胞内ROS的变化情况 |
| 3.3 TMP通过ROS介导结肠癌细胞发生线粒体途径凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 川芎嗪在裸鼠移植肿瘤中诱导凋亡作用 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 裸鼠移植肿瘤模型 |
| 2.2 丙二醛(MDA)检测 |
| 2.3 Caspase 3和Caspase 9蛋白活性检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TMP在裸鼠移植肿瘤中具有抑制肿瘤增殖的效果 |
| 3.2 TMP增加裸鼠移植肿瘤内ROS积累并诱导凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 攻读博士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）基于L-OPA1探讨补阴牵正方调控线粒体动态平衡防治帕金森病的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 OPA1的结构、功能及其与神经退行性疾病的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 OPA1的结构 |
| 3 OPA1的功能 |
| 4 OPA1与神经退行性疾病 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 线粒体在中医“阴阳”、“五脏”中的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 线粒体的结构 |
| 3 线粒体的功能 |
| 4 线粒体与中医“阴阳”的研究 |
| 5 线粒体与中医“五脏”的研究 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 BYQZF对PD细胞模型线粒体形态结构和功能的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三节 研究结果 |
| 1 BYQZF对PD细胞模型存活率和凋亡率的影响 |
| 2 BYQZF对PD细胞模型超微结构的影响 |
| 3 BYQZF对PD细胞模型线粒体形态的影响 |
| 4 BYQZF对PD细胞模型线粒体相关功能的影响 |
| 5 BYQZF对PD细胞模型CytC蛋白表达水平的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 BYQZF对PD细胞模型线粒体分裂融合蛋白的影响及作用机制 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三节 研究结果 |
| 1 BYQZF对PD细胞模型线粒体分裂蛋白表达的影响 |
| 2 BYQZF对PD细胞模型线粒体融合蛋白表达的影响 |
| 3 BYQZF对PD细胞模型GSK3β、OMA1蛋白表达的影响 |
| 4 BYQZF对PD细胞模型线粒体分裂蛋白亚细胞定位的影响 |
| 5 BYQZF对PD细胞模型线粒体融合蛋白亚细胞定位的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 BYQZF对L-OPA1调控PD细胞模型线粒体形态和功能的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三节 研究结果 |
| 1 SH-SY5Y细胞中L-OPA1过表达的鉴定 |
| 2 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型存活率及凋亡率的影响 |
| 3 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型线粒体形态的影响 |
| 4 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型线粒体相关功能的影响 |
| 5 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型CytC蛋白的影响 |
| 6 SH-SY5Y细胞中L-OPA1敲减的鉴定 |
| 7 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型存活率和凋亡率的影响 |
| 8 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型线粒体形态的影响 |
| 9 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型线粒体相关功能的影响 |
| 10 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型CytC蛋白的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 BYQZF对L-OPA1调控PD细胞模型线粒体分裂融合蛋白的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三节 研究结果 |
| 1 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型线粒体分裂蛋白表达的影响 |
| 2 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型线粒体融合蛋白表达的影响 |
| 3 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型线粒体分裂蛋白亚细胞定位的影响 |
| 4 BYQZF对L-OPA1过表达调控PD细胞模型线粒体融合蛋白亚细胞定位的影响 |
| 5 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型线粒体分裂蛋白表达的影响 |
| 6 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型线粒体融合蛋白表达的影响 |
| 7 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型线粒体分裂蛋白亚细胞定位的影响 |
| 8 BYQZF对L-OPA1敲减调控PD细胞模型线粒体融合蛋白亚细胞定位的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 BYQZF对PD动物模型脑GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三节 研究结果 |
| 1 BYQZF对PD小鼠黑质DA神经元的影响 |
| 2 BYQZF对PD小鼠黑质神经元超微结构的影响 |
| 3 BYQZF对PD小鼠脑线粒体膜电位的影响 |
| 4 BYQZF对PD小鼠模型脑线粒体分裂蛋白表达的影响 |
| 5 BYQZF对PD小鼠模型脑线粒体融合蛋白表达的影响 |
| 6 BYQZF对PD小鼠模型脑GSK3β、OMA1蛋白表达的影响 |
| 7 BYQZF对PD小鼠模型黑质线粒体分裂蛋白亚细胞定位的影响 |
| 8 BYQZF对PD小鼠模型黑质线粒体融合蛋白亚细胞定位的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）丹参酮Ⅰ通过BNIP3/NIX介导的线粒体自噬和代谢重编程抑制宫颈癌转移机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 丹参酮I对宫颈癌细胞增殖迁移作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 CCK-8实验 |
| 2.3 集落实验 |
| 2.4 细胞计数 |
| 2.5 细胞凋亡实验 |
| 2.6 细胞周期实验 |
| 2.7 Transwell小室实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 丹参酮I显着抑制宫颈癌细胞活性 |
| 3.2 丹参酮I诱导宫颈癌细胞凋亡 |
| 3.3 丹参酮I诱导宫颈癌细胞周期阻滞 |
| 3.4 丹参酮I显着抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 4 讨论 |
| 第二章 丹参酮I对宫颈癌细胞线粒体自噬和线粒体功能的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞内总LC3B检测 |
| 2.2 细胞内自噬流检测 |
| 2.3 线粒体数量检测 |
| 2.4 线粒体与溶酶体共定位检测 |
| 2.5 线粒体膜电位检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 丹参酮Ⅰ显着诱导宫颈癌细胞自噬 |
| 3.2 丹参酮Ⅰ显着增加线粒体数量 |
| 3.3 丹参酮Ⅰ显着促进线粒体与溶酶体共定位 |
| 3.4 丹参酮Ⅰ显着降低宫颈癌细胞线粒体膜电位 |
| 4 讨论 |
| 第三章 基于RNA测序、蛋白表达和分子对接的丹参酮Ⅰ诱导宫颈癌细胞线粒体自噬机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA测序实验 |
| 2.2 Western Blots实验 |
| 2.3 分子对接实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 丹参酮Ⅰ显着影响宫颈癌细胞基因表达 |
| 3.2 丹参酮Ⅰ显着影响宫颈癌细胞线粒体自噬和炎症相关蛋白的表达 |
| 3.3 丹参酮Ⅰ与BNIP3/NIX的分子对接 |
| 4 讨论 |
| 第四章 基于~1H NMR代谢组学的丹参酮Ⅰ诱导宫颈癌细胞线粒体自噬机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 代谢组学实验 |
| 3 实验结果 |
| 丹参酮Ⅰ对宫颈癌细胞代谢活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 结论 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 线粒体调控肿瘤发生研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肺癌现状与放射治疗 |
| 1.1.1 肺癌现状 |
| 1.1.2 肺癌放射治疗及综合治疗进展 |
| 1.2 DNA损伤形成及应答 |
| 1.2.1 DNA损伤在放射治疗中的形成 |
| 1.2.2 DNA损伤监督 |
| 1.2.3 DNA损伤识别修复 |
| 1.2.4 DNA损伤诱导的细胞死亡 |
| 1.3 线粒体功能紊乱 |
| 1.3.1 线粒体功能紊乱与癌症的形成和发展 |
| 1.3.2 线粒体与辐射抗拒性 |
| 1.3.3 Ras/PI3K/Akt/mTOR通路 |
| 1.3.4 线粒体翻译 |
| 1.4 DNA损伤应答和线粒体功能紊乱的相互作用 |
| 1.4.1 细胞核与线粒体之间的双向信号 |
| 1.4.2 DNA损伤应答与线粒体功能的共同调控通路 |
| 1.5 本文研究目的及意义 |
| 第2章 重离子诱导非小细胞肺癌复杂性DNA损伤的识别及修复 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 细胞来源 |
| 2.2.2 试剂及药品 |
| 2.2.3 主要使用仪器 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 细胞培养传代 |
| 2.3.2 辐照与博来霉素处理 |
| 2.3.2.1 X射线辐照 |
| 2.3.2.2 碳离子辐照 |
| 2.3.2.3 博来霉素处理 |
| 2.3.3 细胞增殖检测CCK-8 实验 |
| 2.3.4 克隆形成实验 |
| 2.3.5 DNA凝胶电泳及DNA损伤频率的计算 |
| 2.3.6 免疫荧光试验 |
| 2.3.7 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 2.3.8 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 非小细胞肺癌对X射线和碳离子的辐射敏感性具有差异 |
| 2.4.2 X射线辐照及联合博来霉素对A549 细胞活性的影响 |
| 2.4.3 碳离子联合博来霉素诱导最明显的复杂DSB损伤 |
| 2.4.4 复杂DSA损伤的动态识别 |
| 2.4.5 复杂DNA损伤的主要修复方式可能为非同源末端连接(NHEJ) |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 重离子联合替加环素诱导非小细胞肺癌线粒体功能紊乱的机理研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 细胞来源 |
| 3.2.2 试剂及药品 |
| 3.2.3 主要使用仪器 |
| 3.3 实验方法与步骤 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 辐照与替加环素处理 |
| 3.3.2.1 碳离子辐照 |
| 3.3.2.2 替加环素处理 |
| 3.3.3 克隆形成实验 |
| 3.3.4 免疫荧光实验 |
| 3.3.5 细胞凋亡实验 |
| 3.3.6 细胞内ATP检测 |
| 3.3.7 线粒体膜电势检测 |
| 3.3.8 线粒体内Ca~(2+)水平检测 |
| 3.3.9 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 碳离子、替加环素以及两者联合作用均能显着抑制肺癌细胞增殖 |
| 3.4.2 碳离子、替加环素以及两者联合作用均诱导线粒体功能紊乱 |
| 3.4.3 碳离子、替加环素及两者联合作用诱导细胞凋亡 |
| 3.4.4 碳离子、替加环素及两者联合作用在H1299 细胞中诱导自噬 |
| 3.4.5 碳离子通过Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白 |
| 3.4.6 碳离子通过p53和Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白 |
| 3.4.7 P53 缺失的H1299 细胞对线粒体翻译抑制更加敏感 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 DNA损伤与线粒体功能紊乱的共同应答通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 细胞来源 |
| 4.2.2 试剂及药品 |
| 4.2.3 主要使用仪器 |
| 4.3 实验方法与步骤 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 辐照与抑制剂处理 |
| 4.3.2.1 辐照 |
| 4.3.2.2 抑制剂处理 |
| 4.3.3 克隆形成实验 |
| 4.3.4 线粒体内Ca~(2+)水平检测 |
| 4.3.5 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 4.3.6 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ATM抑制剂KU-55933 增加A549 细胞对碳离子的辐射敏感性 |
| 4.4.2 抑制ATM下调碳离子辐照后DSB损伤修复蛋白的表达 |
| 4.4.3 KU-55933 增加碳离子辐照后线粒体Ca~(2+)水平 |
| 4.4.4 ATM调控p53和mTOR参与碳离子辐照应答 |
| 4.4.5 自噬受ATM通路的调控参与碳离子应答 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文及研究成果 |
四、线粒体与细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]骨关节炎与线粒体异常[J]. 金涛,刘林,朱晓燕,史宇悰,牛建雄,张同同,吴树金,杨青山. 中国组织工程研究, 2022(09)
- [2]煤尘暴露致人支气管上皮细胞肿瘤样转化效应及其机制研究[D]. 李阿敏. 安徽理工大学, 2021(02)
- [3]紫丁香苷的提取分离工艺优化及对HGC-27细胞增殖抑制作用机制研究[D]. 何嘉欣. 哈尔滨商业大学, 2021(02)
- [4]健脾祛湿和络方上调线粒体自噬减少被动Heymann肾炎大鼠足细胞调亡的机制研究[D]. 王新慧. 中国中医科学院, 2021(02)
- [5]Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制[D]. 金永哲. 延边大学, 2021(02)
- [6]血根碱对线粒体自噬的抑制作用及其毒性作用研究[D]. 杨学亮. 齐鲁工业大学, 2021(10)
- [7]川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究[D]. 李华. 南京中医药大学, 2021(01)
- [8]基于L-OPA1探讨补阴牵正方调控线粒体动态平衡防治帕金森病的机制[D]. 马浩洁. 北京中医药大学, 2021(02)
- [9]丹参酮Ⅰ通过BNIP3/NIX介导的线粒体自噬和代谢重编程抑制宫颈癌转移机制的研究[D]. 陈婷婷. 扬州大学, 2021(08)
- [10]电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究[D]. 严俊芳. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2021(01)