一、不同发育阶段人皮肤β1整和素及细胞角蛋白K19表达特征及其与创面修复结局关系的研究（论文文献综述）
吴涛[1]（2020）在《小鼠皮肤损伤后表皮干细胞标志物表达的时间相关性研究》文中研究指明目的:损伤时间推断是法医工作者研究的重点和难点,当前研究主要集中在皮肤损伤和脑损伤模型基础上的基于蛋白、细胞因子等物质表达变化的时间相关性研究。皮肤损伤的情况在案件中最为多见,皮肤损伤时间推断就成为法医工作进行突破的关键,皮肤愈合最为重要的就是表皮的愈合,利用表皮干细胞（epidermal stem cell,ESC）在皮肤表皮愈合过程中的变化来进行损伤时间推断的研究成为一种可能。表皮干细胞标志物β1整合素（Integrinβ1）、P63、角蛋白19（keratin 19,K19）是其重要的表面标记物,本研究通过建立小鼠皮肤酸性烧伤和碱性烧伤两种皮肤损伤动物模型,研究其损伤后不同时间表皮干细胞标志物β1整合素、P63、K19的表达变化规律,分析其与损伤时间的相关性。方法:利用碱性物质Na OH和酸性物质HCL分别建立小鼠皮肤Ⅱ度（浅Ⅱ度-深Ⅱ度）酸、碱性烧伤动物模型,在损伤后1d、2d、3d、5d、7d、10d、12d、14d对损伤处皮肤取材,并进行肉眼观察、HE、免疫组化染色等组织病理检验,比较损伤后不同时间表皮干细胞标志物β1整合素、P63、K19表达变化情况,进行统计学分析,分析三个标志物表达变化与皮肤损伤时间的相关性。结果:采用5mol/L的氢氧化钠（Na OH）作用于小鼠背部皮肤,能够形成小鼠皮肤Ⅱ度（浅Ⅱ度-深Ⅱ度）烧伤。伤后皮肤经过愈合,从1d组开始,各时间点的表皮厚度逐渐增加,到7d到达高峰,之后表皮厚度逐渐降低,各实验组与对照组的表皮厚度存在显着差异（P﹤0.05）。对照组皮肤表皮干细胞标志物P63在表皮基底层见少量阳性表达,阳性细胞呈单层排列,实验组P63阳性表达细胞数增多,主要分布在表皮基底层、棘层和颗粒层,P63蛋白表达逐渐增多,至5d时达到峰值,后逐渐降低,各实验组与对照组的P63阳性细胞计数值存在显着差异（P﹤0.05）;实验组K19和β1在表皮细胞有明显阳性表达,两个标志物的平均光密度值随时间的增加呈现早期升高,3d组开始逐渐降低,5d组及以后保持较低水平。采用6mol/L的盐酸（HCL）作用于小鼠背部皮肤,能够形成小鼠皮肤Ⅱ度（浅Ⅱ度-深Ⅱ度）烧伤。伤后皮肤经过愈合,从1d组开始,各时间点的表皮厚度逐渐增加,到10d到达高峰,之后表皮厚度逐渐降低,各实验组与对照组的表皮厚度存在显着差异（P﹤0.05）。对照组皮肤表皮干细胞标志物P63在表皮基底层见少量阳性表达,实验组P63阳性表达细胞数增多,主要分布在表皮基底层、棘层和颗粒层,P63蛋白表达逐渐增多,至10d时达到峰值,后逐渐降低,实验组与对照组的P63阳性细胞计数值存在显着差异（P﹤0.05）;实验组K19和β1在表皮细胞有明显阳性表达,两个标志物的平均光密度值随时间的增加呈现早期略升高,3d组后降低的变化,5d组及以后保持较低水平。结论:1.酸、碱性烧伤后皮肤愈合过程无明显不同,表皮明显增厚,在7d或10d达到高峰,可以结合表皮厚度的变化来推测损伤时间。2.表皮干细胞在皮肤损伤后表皮的愈合过程中发挥重要作用,β1整合素、P63、K19均有阳性表达。3.β1整合素和角蛋白19在表皮愈合过程中,愈合早期增加明显,可以帮助我们推断损伤早期时间,但愈合中晚期表达变化与损伤时间相关性不明显。4.表皮干细胞标志物P63在表皮愈合过程中呈先增加后降低的变化趋势,与损伤时间存在相关性,可以为损伤时间推断提供帮助。
郭志侯[2]（2019）在《角膜缘干细胞标志物及其干性相关通路的研究》文中指出角膜缘干细胞（LSCs）是一种可以被用来作为干细胞生物学基础研究的理想材料。迄今为止,LSCs特异性标志物仍未被确立。本文旨在以小鼠为实验动物模型,利用免疫组化、转录组学和蛋白质组学分析,探究LSCs标志物及其干性相关通路。本研究首先通过HE染色观察角膜缘上皮组织学结构,发现了小鼠角膜缘上皮基底中并未存在Vogt氏栅状皱纹（POV）结构,说明小鼠LSCs可能具有自己独特的niche结构。同时,利用角膜上皮细胞（CECs）、结膜上皮细胞和LSCs已知的可能标志物,对小鼠的眼角膜组织进行免疫组化染色,发现LSCs标志物具有独特的空间表达模式,并推测该结果与年龄因素相关。我们遂以出生前和出生后不同发育时间的小鼠角膜、角膜缘组织为样品进行HE染色和免疫组化染色。通过HE染色观察,发现小鼠角膜发育早期以上皮下基质发育为主,在P14眼睑睁开后,光刺激促进角膜上皮发育,转为以角膜上皮发育为主,且在整个发育过程中也均未观察到POV结构。通过免疫组化染色观察,发现LSCs标志物在发育过程中呈动态表达,按照其在发育过程中CECs表达减弱的时间先后顺序排序如下:Vim>p63>CK15>CK14,说明LSCs标志物的表达具有时间特性,其中Vim的表达仅在E19之前可在小鼠眼角膜的上皮细胞膜上被检测到,CK15的表达在P14之后仅在LSCs可被检测到,而p63和CK14则在CECs持续低表达,说明CK15更适合作为P14后LSCs的标志物。我们进一步利用转录组测序和蛋白质组测序进行LSCs标志物的研究。采用Illumina Hiseq Xten对4周龄小鼠角膜及角膜缘组织进行转录组测序,利用qRTPCR验证测序分析结果可靠（相关系数为0.7598）,通过差异分析获得1907和395个在角膜缘中分别显着性上调和下调的基因。发现显着上调基因的GO条目与离子转运,组织发育调节,视觉感知和细胞粘附等有关,富集到的KEGG通路中ECM-受体相互作用、PI3K-AKT、MAPK通路参与LSCs干性的维持。我们还利用Label-free LC-MS/MS进行蛋白组学的分析,并通过免疫印迹试验验证测序分析结果可靠。通过差异分析获得804和76个分别在角膜缘中显着性上调和下调的蛋白,基于这些差异表达的蛋白进行免疫组化染色和功能注释。通过免疫组化染色,我们发现3个新的LSCs候选标志物,即ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2。通过基于显着上调蛋白的功能注释分析,发现细胞粘附蛋白和Focal粘附通路对LSCs干性表型的维持具有重要的作用。最后,将转录组和蛋白质组数据进行关联分析,获得相对于角膜组织而言,在角膜缘组织的转录水平和蛋白质水平中表达趋势一致的DEGs和DEPs,其相关性为0.7357（斯皮尔曼系数）。然后利用这些表达趋势一致的DEGs和DEPs进行生物信息学分析,发现细胞的外泌体参与CECs和LSCs的信息交流,且在LSCs niche中,细胞外基质蛋白可能作为关键性节点蛋白通过激活Focal粘附、ECM-受体相互作用、PI3K-AKT通路对LSCs的细胞周期、增殖、分化、迁移和存活等多种干性相关表型的维持具有重要作用。综上所述,本研究首次揭示了小鼠LSCs标志物表达的时间光谱,证明了标志物在LSCs表达所特有的时间性。在未能确定持续性的LSCs特异性标志物的情况下,可以根据不同的生理年龄选择相应的标志物识别LSCs。本研究并还首次基于转录组和蛋白质组测序分析,发现了三个新的LSCs候选标志物及其干性相关通路。这些发现为LSCs的识别、分离及其干性的维持提供不同层面的实验数据,为探究LSCs niche内单细胞之间的异质性奠定基础。
仇莲胤[3]（2019）在《黄芪注射液介导Wnt/β-Catenin信号通路调控表皮干细胞增殖分化促进糖尿病溃疡愈合的机制研究》文中研究说明目的:观察黄芪注射液对糖尿病溃疡创面的治疗效果,探讨其促进糖尿病溃疡创面愈合的作用机制。方法:将192只大鼠除正常对照组外,其余大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）建立糖尿病模型（diabetes mellitus,DM）,随机分为糖尿病模型组、表皮生长因子组、黄芪注射液小剂量组、黄芪注射液中剂量组及黄芪注射液大剂量组。8周以后在大鼠背部作以深达深肌膜、直径为20mm的全层皮肤缺损开放性创面,即糖尿病溃疡模型（diabetic ulcer,DU）。于创面造模后第2天开始药物干预,观察创面愈合率、创面愈合时间;在创面愈合过程中（造模后的第7天、第14天、第21天）,切取创面内及创周皮肤组织,采用HE染色观察创面组织形态结构的变化;应用免疫组化观察β1整合素、K19、PCNA的水平变化;运用Western Blot、Real Time-q PCR等相关技术,分别从m RNA和蛋白水平,观察Wnt1、Wnt3a、β-catenin、GSK3β、Cmyc、Cyclin D1的表达变化,以细胞信号转导通路及表皮干细胞角度,围绕“上皮化-Wnt/β-Catenin信号转导通路-创面修复”重要病理机制,探讨黄芪注射液促进糖尿病性溃疡愈合的作用机制。结果:1、动物糖尿病造模情况:糖尿病模型组大鼠注射STZ之后,体重、血糖较正常对照组有明显差异（P<0.05）。2、创面愈合率、创面愈合时间比较:DU组创面造模后第3、7、14、21天,创面愈合率均明显低于正常创面组（P<0.01）;创面造模后第14、21天,黄芪注射液大剂量组创面愈合率高于DU组（P<0.01）。DU组与正常创面组比较,创面愈合时间明显延长（P<0.01）;各药物干预组中,黄芪注射液大剂量组创面愈合时间少于DU组（P<0.05）。3、创面组织免疫组化结果显示:在创面造模后第7、14、21天,DU组创面组织K19、β1整合素、PCNA的表达均明显低于正常创面组（P<0.01）;在这三个时间点,黄芪注射液大剂量组、表皮生长因子组创面组织K19、β1整合素、PCNA的表达均高于DU组（P<0.01）,黄芪注射液大、中剂量组K19、β1整合素、PCNA表达高于黄芪注射液小剂量组（P<0.05）。4、创面组织Western Blot结果:在创面造模后第7、14、21天,DU组创面组织β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白的表达均明显低于正常创面组（P<0.01）,DU组β-catenin核内表达低于正常创面组（P<0.01）,DU组GSK-3β的表达高于正常创面组（P<0.05）。在这三个时间点,各药物干预组与DU组相比,表皮生长因子组、黄芪注射液大、中剂量创面组织β-catenin、β-catenin核内、C-myc的表达均高于DU组（P<0.05）;在GSK-3β的表达上,创面造模后第7、14天,表皮生长因子组、黄芪注射液大剂量组均低于DU组（P<0.05）。创面造模后第7、14、21天,黄芪注射液大剂量组β-catenin、β-catenin核内蛋白的表达均高于小剂量组（P<0.01）,创面造模后第14、21天,GSK-3β的表达明显低于黄芪注射液小剂量组（P<0.01）。5、创面组织Real Time-q PCR结果显示:在创面造模后第7、14、21天,DU组创面组织β-Catenin m RNA表达明显低于正常创面组（P<0.01）,GSK3βm RNA的表达高于正常创面组（P<0.01）;这三个时间点,各药物干预组与DU组相比,表皮生长因子组、黄芪注射液大剂量组创面组织β-Catenin m RNA表达高于DU组（P<0.05）,且GSK3βm RNA的表达低于DU组（P<0.05）;在创面造模后第7、14天,黄芪注射液大剂量组β-Catenin m RNA表达高于黄芪小剂量组（P<0.05）,而同时GSK3βm RNA表达低于黄芪小剂量组（P<0.05）。对于创面组织Wnt1、wnt3a m RNA的表达上,在创面造模后第7、14、21天,DU组表达均明显低于正常创面组（P<0.01）;各药物干预组与DU组相比,黄芪注射液大剂量组、表皮生长因子组Wnt1 m RNA、Wnt3a m RNA的表达均高于DU组（P<0.05）;创面造模后第14、21天,黄芪注射液大剂量组Wnt3a m RNA的表达高于黄芪小剂量组（P<0.01）。结论:1.黄芪注射液能提高糖尿病溃疡的创面愈合率,缩短创面愈合时间,有效促进糖尿病溃疡的愈合,且存在着一定的量效关系。2.黄芪注射液可能与Wnt/β-catenin信号通路活化有关,通过上调Wnt1、Wnt3a、β-catenin的表达,启动通路下游靶基因C-myc、Cyclin D1的转录,提高C-myc、Cyclin D1的表达而起到调节Wnt/β-catenin信号通路的作用,促进创面肉芽组织增生,促进表皮干细胞的增殖分化,加快创面上皮化的进程,从而促进糖尿病溃疡的愈合。
张基勋[4]（2019）在《外源性免疫细胞及神经毒素在人胚胎皮肤及正常成人皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤创面愈合过程中的作用观察》文中研究说明目的:构建完整的包括各妊娠阶段胎儿皮肤以及成人皮肤的人化裸鼠模型,并进一步建立皮肤成活后深Ⅱ°烧（烫）伤的损伤修复模型,系统观察各阶段胎儿皮肤在体外的生长发育过程以及深Ⅱ度烧（烫）伤后的损伤修复过程。使用成人炎症免疫细胞以及外源性神经毒素、神经活性肽干预胎儿皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤创面,分析免疫因素及神经因素在胎儿皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤损伤修复与再生过程中的作用及机理。方法:将不同妊娠阶段的人类胚胎皮肤和正常成人皮肤移植于T细胞免疫缺陷的裸鼠背部,采用不同时间的术后皮瓣温孵方法促其成活,通过大体观察及组织病理学染色,系统观察记录各阶段胎儿皮肤及成人皮肤在移植成活后的生长发育变化过程。在此模型基础上,使用恒温控压电烫仪在裸鼠背部移植成活的胎儿皮肤上制作深Ⅱ°烧（烫）伤创面,构建各妊娠阶段胎儿皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤的损伤修复模型,观察烫伤后创面修复过程的组织病理学变化,并检测MMP-2、MMPP-7、MMP-9和TIMP-1在创面修复过程中的表达情况。将外源性的成人炎症免疫细胞（外周静脉全血的单个核细胞）注射于妊娠中期胚胎皮肤的深Ⅱ°烧（烫）伤创面下进行免疫学干预,对比对照组,观察分析其对创面修复与组织再生的影响,并检测炎症免疫细胞干预后MMP-9和TIMP-1的表达情况变化。将外源性的神经性毒素（A型肉毒杆菌毒素）以及外源性神经活性肽（P物质）采用局部注射的方式引入妊娠中期胎儿皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤创面中,与无神经因素干预的对照组比较,观察分析其对创面愈合的影响。结果:各不同妊娠阶段的胎儿皮肤以及成人皮肤在裸鼠背部移植后,经过不同时间的皮瓣下温孵,均顺利获得成活,人化裸鼠模型成功构建。深Ⅱ°烧（烫）伤的损伤修复模型制作顺利,移植成活后的胎儿皮肤在裸鼠背部能够正常生长发育成熟,烧（烫）伤后创面亦可以迅速愈合,且不遗留任何瘢痕外观。MMP-2在创面损伤修复与再生过程中则无明显表达,MMP-7的表达则与创面修复过程密切相关。MMP-9随修复细胞的迁移增殖不断变化,TIMP-1的表达晚于MMP-9,变化规律同MMP-9类似。外源性炎症免疫细胞（hPBMC）的注射延长了深Ⅱ°烧（烫）伤创面愈合的时间并可引起瘢痕形成,也改变了创伤修复与组织再生过程中MMP-9和TIMP-1的表达模式。外源性的神经毒素（A型肉毒杆菌毒素）注射后虽迟滞了创面愈合,但维持了早中期胎儿皮肤无瘢痕愈合的结局特点。外源性的神经活性肽P物质注射干预后则加快了创面的愈合速度。结论:1,妊娠早中晚期的不同人类胚胎皮肤移植于裸鼠背部,经皮瓣下埋置、成活后温孵等合适方法的处理可以获得成活,从而成功建立稳定的人化裸鼠模型。2.人化裸鼠模型中移植成活的早中期胎儿皮肤的生长发育与宫腔内的发育变化过程并无二致。3.构建成功的深Ⅱ°烧（烫）伤创面损伤修复的人化裸鼠模型相对稳定,比较适用于进行人类早期胚胎皮肤的无瘢痕愈合机制以及以深Ⅱ°度烧烫伤为代表的皮肤深层组织坏死缺损后损伤修复再生过程的相关研究。4.基质金属蛋白酶家族深入参与创面组织的修复重建和皮肤附件的发育过程,其中MMP-7与整个创面修复过程密切相关,MMP-2则与皮肤附件的发育联系更为密切,在创伤愈合与组织再生过程中罕见表达,MMP-9及其抑制剂TIMP-1协同调节ECM的沉积与降解,MMP-9/TIMP-1比例的紊乱和不平衡是众多疾病状态的表现和重要的诱发因素。5.早中期胚胎皮肤之所以能实现无瘢痕的再生愈合,与其自身拥有的表皮干细胞的旺盛增殖分化能力、创面局部炎症免疫反应的缺失、细胞外基质降解沉积的及时调控、组织修复细胞的迅速游走和快速定植分化等密切相关。6.在成人炎症免疫细胞的干预下,妊娠中期的人类胚胎皮肤在经深Ⅱ°烧（烫）伤损伤后,创口局部的炎症反应加重,增殖上皮细胞的灵活性和游走性降低,创面的再生重建过程发生迟滞,干扰了无瘢痕愈合的完美再生效果,促进了瘢痕组织的形成。7.在外源性神经活性肽SP的干预下,创面修复与再生的速度明显加快;而使用外源性的神经毒素对局部创面干预后则表现出双重作用,即一方面抑制肉芽组织中Fb的增殖活性,导致创面修复再生过程的迟滞;另一方面,还能调节细胞外基质的构成,主要是胶原沉积的比例,从而减少了瘢痕增生和挛缩发生的几率。
张敏[5]（2018）在《CD271联合TrkA受体通过促进表皮干细胞的增殖和迁移促进创面愈合的初步研究》文中研究指明研究背景烧伤后创面愈合问题显着降低了患者的心理和身体的生存质量,甚至会威胁他们的生命。近年来许多治疗方法应用到临床创面治疗上,包括干细胞治疗,但是目前依然没有完美有效的治疗方法。因此,我们急需一种完美修复创面而且价格又可以承受的治疗方法应用于烧伤的创面治疗。表皮干细胞主要来源于皮肤基底层,占基底层细胞数的2%4%,具有分化为表皮角质形成细胞和皮肤其他附属器官的潜能,并且是皮肤组织创伤再生和修复的理想的种子细胞。表皮干细胞的表面标记物有Cytokeratin（CK）19和lntegrin-β 1（β 1）,分化为成熟的角质形成细胞后则CK10表达阳性。CD271,是神经生长因子的受体,即p75受体,可以调节多种干细胞的增殖、凋亡和分化,并且还有研究表明CD271可能在促进皮肤的创面愈合过程中起着重要作用,然而表皮干细胞中的CD271促进创面愈合的具体机制却不明了。作为神经生长因子的另一个受体TrkA,既往研究提示CD271和TrkA可以互相调控彼此的表达,CD271和TrkA的比率关系也可以影响细胞的增殖能力等。然而在皮肤中,尤其是表皮干细胞中CD271是否受到TrkA的调控作用并不明确。另外ERK、AKT和JNK信号通路也可能参与皮肤的创面愈合过程。本实验意在研究在皮肤创面愈合过程中,CD271的过表达的表皮干细胞是否可以促进创面愈合,以及CD271是否联合TrkA在创面愈合过程中通过促进表皮干细胞的迁移和增殖进而促进创面愈合。目的探讨CD271是否影响表皮干细胞的生物学特性及是否促进创面愈合,并且进一步研究表皮干细胞中的TrkA在CD271引起的创面愈合过程中的作用和机制。材料和方法1、体外细胞实验（1）表皮干细胞的分离培养本实验所涉及到的动物实验的处理依从山东大学动物伦理委员会的行为规范。提取新出生的乳鼠皮肤,使用25%的戊巴比妥溶液麻醉乳鼠,处死乳鼠,75%的酒精消毒皮肤,铺巾,取下乳鼠背部腹部的全部皮肤,放入23ml冰的PBS溶液中。在超净台操作,采用DispaseII酶消化的方法取下表皮层,丢弃真皮层,将剥离的表皮层用PBS冲洗三次,使用无菌剪刀剪碎,放入0.05%的胰酶室温下消化10分钟,用表皮细胞的全培养基终止消化,用200目的滤网过滤后,l000rmp,5分钟,室温离心,弃去上清,加入适量的表皮干细胞专用KSFM培养基（Serum-free medium,Gibco）混匀,放入37℃、5%CO2的细胞孵育箱里面培养。3天后更换培养基,提前预热37℃的PBS轻轻冲洗不能贴壁的细胞,当细胞长到80%90%以上的时候给予传代。（2）转染慢病毒把表皮干细胞（P3）铺在96孔板里,培养24小时,然后提前一天转染慢病毒,以1×105/孔的细胞铺到24孔板中。培养细胞数量为2×105/孔左右,转染慢病毒。用含6 u g/ml polybrene的23ml新鲜的培养基替换旧的培养基后,然后再加入适量的病毒悬液。37°C孵育。4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。继续培养细胞,再用新鲜培养基替换原来含有病毒的旧的培养基,再继续培养细胞。用敲除了 CD271的慢病毒（含有荧光蛋白）,在转染病毒48小时后,转染效率高,可见有很多荧光表达,72小时后会更加明显。（3）应用K252a降低TrkA的表达将CD271正常表达和CD271过表达的表皮干细胞培养在表皮干细胞专用培养基中并铺板使密度大概为1× 105左右,并使用100nM K252a（Santa Cruz Biotechnology Company,CA）预处理 24 小时。（4）细胞增殖能力检测将CD271过表达、低表达及正常对照组表皮干细胞（P4）,以及给予K252a试剂干预后的表皮干细胞使用细胞克隆、CCK-8和细胞增殖检测试剂盒等方法进行检测。（5）细胞迁移能力检测为了检测细胞的迁移能力,我们使用了 Transwell实验。小室膜孔径8 μm,各组细胞种于小室上层,小室上层为无表皮生长因子的培养基,下层为表皮干细胞专用培养基。用孵箱培养各组细胞24小时,用PBS冲洗,再用棉签擦去Transwell上室内的细胞,用95%的乙醇固定微孔膜下层的细胞,再苏木素染色2分钟,通过采用表皮生长因子作为诱导,计数相同面积下穿透聚碳酸酯膜的细胞数量,以此判断细胞的迁移能力。（6）细胞凋亡能力检测流式细胞术可以用于检测表皮干细胞的凋亡能力。Q2代表着凋亡的比率,Q4代表着死亡的比率。将表皮干细胞,大约IX 106个细胞每孔,消化下来再用5 μ 1的PE-7-AAD和Annexin-V-FITC染色,在室温下避光染色15分钟。Hoechst 3342/PI或者TUNEL/DAPI双染实验检测细胞的凋亡。将处理过的的表皮干细胞,大约1×106个细胞每孔,提前24小时种到24孔板里。再用PBS清洗后,Hoechst33342/PI或者TUNEL/DAPI加入到培养基里并孵育15分钟。在荧光显微镜底下观察,并即时拍照计数死亡和所有的细胞。2、体内动物实验（1）深II度烧伤模型设计随机抽取C57BL/6小鼠（6周,雄性,2025克）。首先给予25%戊巴比妥溶液麻醉6周龄的雄性小鼠,35mg/kg,成功麻醉后,将小鼠背毛剃除干净,碘伏酒精消毒,在100℃水浴直径0.5厘米的铜块放于小鼠背部4秒钟,制作深II度烧伤模型。动态观察小鼠烧伤创面愈合的过程,在0天、7天、14天和21天分别取材。（2）皮肤全层缺失的模型设计C57BL/6小鼠（6周,雄性,20～25克）,给予正常饮食,将小鼠麻醉（给予25%戊巴比妥,35mg/kg）,剃去小鼠的毛发,并75%酒精消毒,使用直径大小0.5厘米的模具在小鼠背部制作创面,然后使用5ml的林格液复苏麻醉的小鼠。在0天、3天和7天拍照测量创面面积,并在7天时取小鼠创面包括周边2mm的皮肤,用于做免疫组织化学染色和Western blot实验分析。（3）K252a药物抑制TrkA表达的动物模型制备K252a 是 TrkA 受体的抑制剂[36,37]。购自 Santa Cruz Biotechnology 公司。15μgK252a（10μg/mg）溶解在含2%的DMS0的生理盐水中,在-20°C的黑暗环境中保存。C57BL/6小鼠（2025克,雄性,6周）随机分成4组,每组5只。在Control组和CD271组腹腔注射含2%DMS0的生理盐水,在K252a组和CD271+K252a组则注射溶解有K252a药物的2%DMS0生理盐水（5μg/kg）。提取皮肤组织蛋白,Western blot方法检测TrkA的表达情况。（4）表皮千细胞干预创面愈合的实验4.1 C57BL/6小鼠（6周,雄性,2025克）随机分组,每组6只小鼠,按照上述的步骤制作深II度烧伤模型。将等体积（150 μl PBS）且等细胞数量（1X 10～7）的四代CD271正常表达和CD271过表达的表皮干细胞注射到制作创面后的当天、3天和5天的创面周围5mm的真皮层。随后在当天、7天、14天和21天时测量创面面积并拍照。创面的面积采用游标卡尺测量。在第21天的时候取创面及周边的皮肤,检测相关指标的表达情况。4.2使用K252a（5 μg/kg）腹部注射制作TrkA表达缺失的小鼠模型。Western blot检测在皮肤组织中TrkA表达缺失后,按照上述描述（2）制作直径0.5厘米的皮肤全层缺失的创面模型。同理将等体积且等细胞数量的正常及CD271过表达的表皮干细胞注射到制作创面后的当天、3天和5天的创面周围皮肤的真皮层中,然后在当天、3天和7天时测量创面面积并拍照。在第7天的时候取创面及周边的皮肤,检测相关指标的表达情况。（5）免疫组织化学染色1)脱蜡:60°C条件下烘片,将片子然后依次放入无水的乙醇,95%的乙醇,85%的乙醇,70%的乙醇和蒸馏水中,2)抗原修复:把抗原修复液预热,再把切片放入修复液中,继续加热约1分钟后关掉电源,自然冷却到室温,3)免疫组织化学染色的实验过程:内源性过氧化物酶室温下封闭2030分钟后;然后按照一抗说明书稀释一抗（β 1,CD271,CK19和CK10）,滴加一抗后4°C过夜孵育;37°C下滴加Polymer helper后孵育20～30分钟;在37°C下滴加生物素化二抗后孵育20～30分钟;最后用DAB染色后在显微镜底下观察;最后用苏木素染色;等片子干燥后封片,加中性树胶覆盖片子,晾干;显微镜拍照。（6）Western blot 检测按照实验步骤提取各组细胞和动物皮肤组织中的蛋白,灌胶、电泳、转膜孵育一抗过夜后,显影检测实验中CD271和表皮干细胞表面标记物,如CK10、CK19和β 1的表达。同时测定磷酸化Akt,ERK和JNK信号通路的表达变化情况。3、统计学分析对上述实验数据使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。两组之间正态分布的数据的比较使用单因素方差分析,t检验。多组之间数据的比较使用AN0VA检验。本实验研究中所得的数据均使用（平均值土标准差）表示。当P<0.05的时候,说明数据具有明显的统计学意义。实验结果1、细胞实验（1）CD271调控表皮干细胞的分化表皮干细胞的分化能力在皮肤创面愈合过程中发挥作用。因此我们实验研究了 CD271在表皮干细胞中的分化作用。将表皮干细胞培养在胶原包被的培养瓶中,通过转染慢病毒我们得到CD271过表达的表皮干细胞（CD271-vo eSCs）和CD271低表达的表皮干细胞（CD271-kd eSCs）以及转染了空病毒的对照组表皮干细胞（Control eSCs）。可以通过判断带有绿色荧光的细胞来判断病毒是否转染细胞成功,并可以粗略判断转染效率。免疫组织化学染色和Western blot结果显示我们得到CD271-vo表皮干细胞和CD271-kd表皮干细胞以及对照组表皮干细胞。CD271在表皮干细胞的分化作用利用CK10、CK19和β 1的表达量多少来表示。当CD271过表达时,CK10表达升高而CK19表达下降,相反的,当CD271低表达时,CK10表达降低而CK19和βl表达升高。这些结果表明CD271可以有效的调控表皮干细胞的分化。（2）CD271调控表皮干细胞的增殖凋亡和迁移能力接下来我们检测了 CD271对于表皮干细胞凋亡和增殖方面的影响。我们使用了流式细胞术、细胞克隆和CCK-8等方法检测细胞的增殖。对比Control组表皮干细胞,CD271-vo表皮干细胞G2期增多,CD271-kd表皮干细胞G2期减少。在细胞克隆和CCK-8测细胞增殖的实验中我们也可以得到类似的结果。表皮干细胞的凋亡能力用Hochest/PI染色、TUNEL/DAPI染色和流式细胞术检测,得到跟增殖能力测定实验观点一致的结论。Transwell实验用来检测细胞的迁移能力,CD271-vo表皮干细胞的迁移能力增高而CD271-kd表皮干细胞迁移能力下降。这些结果显示CD271促进了表皮干细胞的增殖能力和迁移能力。（3）CD271可以调节TrkA的表达TrkA是神经生长因子的另一个受体。有研究表明TrkA和CD271表达的比率可以通过神经生长因子影响细胞的增殖和存活。所以我们使用了免疫组织化学染色和Western blot对TrkA在细胞中的表达情况进行了检测。当CD271表达增高时TrkA表达降低,当CD271表达降低时TrkA表达增高。（4）K252a抑制表皮干细胞的TrkA表达后,CD271过表达的表皮干细胞的凋亡能力增加前文已经说到,K252a是抑制TrkA受体的试剂。通过转染慢病毒和加药,我们得到对照组的表皮干细胞（Control eSCs）,CD271过表达的表皮干细胞（CD271 eSCs）,与K252a共培养的正常表皮干细胞（K252a eSCs）和CD271过表达的表皮干细胞（CD271 eSCs+K252a）。通过流式细胞术检测Control组,CD271 eSCs组,K252a eSCs组和CD271 eSCs+K252a组这四组细胞表达CD271的情况。我们采用流式细胞术测Q2+Q4的比率水平来比较各组之间凋亡能力。我们发现与不加K252a的Control组和CD271 eSCs组相比,加K252a后的两组的Q2+Q4比率均增高,并且CD271过表达同时TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a组在各组中凋亡水平的增高是最明显的。与TUNEL染色结果一致。TrkA抑制后即使CD271过表达,也会增加表皮干细胞的凋亡能力。（5）K252a抑制表皮干细胞的TrkA表达后,CD271过表达的表皮干细胞的增殖能力降低K252a是常用的抑制TrkA表达的抑制剂。通过Western blot判断TrkA被抑制的效率,我们的实验中TrkA完全抑制表达,然后再做流式细胞术测定细胞周期。我们发现与不加K252a组相比,加K252a后的两组的G2期均下降,并且CD271过表达同时TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a组在各组中是增殖能力降低最明显的。与细胞克隆实验结果一致。TrkA抑制后即使CD271过表达也可以降低表皮干细胞的增殖能力。（6）K252a抑制表皮干细胞的TrkA表达后,CD271过表达的表皮干细胞的迁移能力下降K252a是抑制TrkA受体的试剂。我们Transwell实验测细胞穿膜的细胞数目水平来比较各组之间迁移能力。我们发现与不加K252a的Control组和CD271 eSCs组相比,加K252a后的K252a组和CD271+K252a组的穿过膜的细胞数目显着减少,并且CD271过表达同时TrkA抑制的表皮干细胞组在各组中是穿出细胞数目是最少的。TrkA抑制后可以降低表皮干细胞的迁移能力,并且CD271过表达但TrkA不表达也会引起表皮干细胞的迁移能力下降。（7）抑制TrkA表达后,ERK和Akt信号通路的表达降低为了探索可能参与的信号通路,我们提取了 Control组的表皮干细胞,CD271 eSCs组的表皮干细胞,与K252a共培养的K252a eSCs组表皮干细胞和CD271eSCs+K252a组的表皮干细胞这四组细胞的蛋白。利用Western blot的方法测定了 pERK,pAkt和pJNK的蛋白表达水平变化。与Control组的表皮干细胞相比,pERK和pAkt在CD271 eSCs中表达增多,而且在CD271 eSCs+K252a中表达最少。同时发现表皮干细胞与K252a共培养时,pJNK表达增高,并且与CD271的表达高低无关。2、动物实验（1）CD271在烧伤创面愈合过程中表达增多检测CD271在创面愈合过程中的变化情况,CD271表达在创面愈合的中、后期表达越来越高。把在100°C沸水中浸的铜块放在已经剃除毛发的小鼠背部4秒钟,得到深II度烧伤的创面模型。深II度烧伤会累及残留了表皮干细胞的皮肤的表皮层及真皮层。通过检测表皮干细胞的表面标记物（CK19、β1）,我们发现表皮干细胞在创面愈合过程中不断增加,参与创面愈合的过程。我们可以看到创面在第7天和14天时开始愈合,并在第21天时完全愈合。我们在创面愈合过程不同的阶段取材,动态观察创面愈合的过程。我们发现CD271在第7天的时候下降了,但是在第14天和21天时表达增高了。然而CK10在第7天的时候表达降低,而在第14天和21天时表达增高。而免疫组织化学染色显示,CD271和CK19在创面愈合过程中主要表达在增厚的表皮层。β1在基底层也表达增高了。CK19的表达在第7天的时候减少了,在第21天的时候增加。这些结果表明伴随着表皮干细胞的增加,CD271参与创面中、晚期愈合过程。（2）CD271过表达的表皮干细胞可以促进创面愈合通过CD271正常表达和CD271过表达的表皮干细胞干预创面愈合以此判断CD271对创面愈合情况的影响。与注射CD271正常表达的表皮干细胞相比,注射CD271过表达的表皮干细胞的创面在愈合时间和愈合质量上都有提升。这些结果表明CD271过表达的表皮干细胞更加可以促进创面愈合。（3）TrkA可以辅助CD271促进创面的愈合通过腹腔注射K252a（5ug/kg）得到TrkA表达缺失的小鼠,取小鼠皮肤提取蛋白,通过Western blot方法验证得到皮肤中TrkA表达缺失的小鼠模型。制备好全层皮肤缺失的小鼠。愈合模型实验:将小鼠分为给予正常表达表皮干细胞的正常对照组（Control组）,给予CD271过表达表皮干细胞的CD271组,预处理过K252a的给予CD271正常表达的表皮干细胞的K252a组和预处理过K252a的给予CD271过表达的表皮干细胞的CD271+K252a组。在术后的当天、3天和5天的时候,Control组和K252a组给予CD271正常表达表皮干细胞,CD271组和CD271+K252a组给予CD271过表达表皮干细胞的处理。在创面的周边皮肤5mm,注射到皮肤的真皮层。从第3天开始,我们可以看到CD271过表达组创面愈合最快,CD271+K252a愈合最慢,但是在TrkA阻滞后的情况下,CD271过表达并不能引起创面的愈合加快。取上述各组创面愈合第7天时的皮肤组织,进行相关的实验得出,CD271+K252a组的创面愈合边缘,集聚着数量最少的处在增殖期的细胞,和最少量的表皮干细胞。结论我们的实验揭示了CD271促进表皮干细胞的分化、增殖和迁移,CD271在深II度烧伤创面愈合过程的中、后期,也就是再上皮化和重构过程中的起着重要作用。目前的发现可以将CD271和表皮干细胞视作很有前途的治疗创面愈合的靶点。CD271在创面的早期降低,而在中、后期增高,表明CD271在创面愈合的中、后期阶段起作用。我们在创面愈合的早期通过表皮干细胞干预创面的愈合进程,得出表皮干细胞可以促进创面愈合,而CD271可以加速表皮干细胞的增殖分化和迁移,以此促进皮肤的创面愈合过程的结论。除此之外,神经生长因子的另一个受体TrkA的表达在CD271过表达的表皮干细胞中表达降低了。之前的研究显示TrkA的作用不明确,可能促进,也可能抑制细胞的生物学特性,也有实验表明TrkA和CD271的比率会影响细胞的生物学行为。因此为了进一步明确TrkA在CD271促进创面愈合的作用,在后续的实验中,我们抑制TrkA的表达后发现即使CD271的增高并不会引起表皮干细胞的促进创面愈合作用。即在CD271的过表达的情况下,TrkA受体的存在可能启动了比率机制引起表皮干细胞的增殖和迁移。本实验还展示了在促进创面愈合过程中,CD271和TrkA可能会通过ERK和Akt信号通路起作用。综上所述,这项实验阐述了 CD271可以通过促进表皮干细胞的增殖分化迁移促进创面愈合;CD271联合TrkA在创面愈合过程中起着重要作用,而且表明了一个潜在的机制——在TrkA存在的条件下,CD271通过促进表皮干细胞的增殖和迁移进而可以促进皮肤创面的愈合。
詹日兴[6]（2016）在《烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理烧伤是以皮肤损伤为始发因素的创伤,损伤主要是皮肤和黏膜,严重者可伤及皮下及黏膜下组织,如骨及关节、肌肉等,甚至内脏器官等。及时封闭、修复创面是防治创面感染、减轻组织器官功能损伤、防治瘢痕增生、提高重度烧伤患者救治成功率及生活质量的基础。烧伤的根本问题就是创面修复,如何尽早封闭和修复创面是烧伤治疗中的根本。表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）是皮肤组织之中特异性干细胞,是皮肤创面愈合最重要的物质基础之一,也是皮肤及其皮肤附属器管生长发育、修复以及改建的源泉。应用表皮干细胞无限增殖能力及多向分化的潜能等,促使创面修复由功能修复到解剖修复成为了可能。因此表皮干细胞对表皮组织及其附属器官的重建具有重大价值。浅度以及深Ⅱ度烧伤创面的修复主要依赖于残存和健在的表皮干细胞脱粘附、增殖、分化以及迁移并最终修复创面,是创面愈合的主要过程,尤其是毛囊外鞘隆突部的毛囊干细胞起着重要的作用;同时表皮干细胞的脱粘附、增殖、分化、迁移等生物学行为受到体内多种因素的影响。表皮干细胞离开其特定的干细胞巢穴迁移,才具有增殖、分化能力,因而表皮干细胞离巢迁移是启动烧伤创面愈合的关键步骤。但目前关于诱使表皮干细胞脱粘附、离巢迁移、增殖、分化的因素及其机制并不清楚。一氧化氮（Nitric Oxide,NO）是众多的小分子生物活性介质中的一种,参与了多种生理、病理等过程。NO在创面的炎症反应、肉芽生长及创面修复中均起着重要的作用,具有参与炎症反应、扩张血管、收缩创面、抗感染以及促进创面胶原合成、成纤维细胞增殖、增强创面抗张强度、血管生成等。烧伤后早期创面即有大量NO产生,在时间上与烧伤后表皮干细胞离巢迁移修复创面现象相重叠。NO对创面愈合有多种作用机制与途径,但NO促进创伤愈合的具体作用机制尚未完全清楚,还有待进一步的深入研究。烧伤后创面产生大量NO产生,初期主要由角质细胞产生,随后主要由活化的巨噬细胞产生。创面局部产生的NO在烧伤后第三天左右达到高峰,并且几乎伴随整个创面愈合的过程。文献报道,在气道上皮细胞的体外划痕实验中NO显着促进细胞的迁移;NO可通过GC-c GMP途径使细胞骨架重排,从而促进气道上皮细胞的迁移与创面修复;NO可通过影响Rho GTP酶调节细胞骨架及细胞的粘附与迁移。因此我们推测,一氧化氮的促进创面修复作用中是通过影响角质细胞及表皮干细胞的脱粘附、增殖、分化、迁移等生物学作用实现的。no在烧伤后表皮干细胞脱粘附、离巢、迁移、分化等生物学变化中的作用及其机制未见文献报道。我们前期研究中,以硝普钠（snp）为no供体,以角质细胞株hacat细胞为研究对象,发现适宜浓度的no具有促进hacat细胞迁移作用,其作用的可能机制是:1、no通过调节细胞内cgmp的浓度升高,促进rhogtpase活化作用增强,以及蛋白表达水平增高,进而影响细胞骨架结构f-actin蛋白聚合,最终促进细胞迁移;2、no通过下调β1整合素的表达,减少细胞对细胞外基质的粘附力,进而减少细胞迁移阻力。同时我们以原代培养人表皮干细胞为研究对象,选择以snap（s-nitroso-n-acetyl-dl-penicillamine）为no供体,深入研究no对体外原代培养人esc脱粘附离巢、增殖分化及迁移功能的影响;并在体实验中通过brdu滞留标记表皮干细胞,浅二度烫伤模型研究外源性no对成年小鼠表皮干细胞离巢、迁移的作用。本课题在前期实验的基础上,我们进而探讨了烧伤患者创面中no浓度及创面中inos的表达,深入研究no促进表皮干细胞迁移的物质基础和可能机制,明确no促进烧伤等创面愈合的机理,为进一步完善一氧化氮在促进创面愈合中的基础理论和可能的临床应用打下基础。本课题重点探讨了no通过cgmppkgrhogtpase途径调节表皮干细胞骨架的重排,进而促进escs迁移;以及在体no通过增强表皮干细胞迁移而促进创面再上皮化,最终修复创面。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下:一、烧伤后创面no的产生:为进一步了解烧伤患者创面中no浓度及烧伤不同时间点no浓度的变化,共收集临床20例烧伤患者标本,其中水泡液46份,血清27份;深二度烧伤创面组织14份,同体正常皮肤组织14份。均符合入选标准:年龄18-55,性别不限,烧伤面积≤40%tbsa。收集水泡液、血清及组织块-80度保存。该项研究内容均告知患者,并征得患者和患者家属的同意,研究对象签署知情同意书表示愿意参加该项试验。1、水泡液及血清中no浓度检测:采用griessreagent法检测发现,小面积（烧伤面积≤40%tbsa）患者血浆中no的浓度相对恒定在6.44±0.71μm;而烧伤患者水泡液中no随伤后不同时间而有较大变化,伤后10小时内的水泡液no浓度为7.73±0.62μm,伤后10至20小时水泡液no浓度为9.45±0.65μm,伤后20至30小时水泡液no浓度为7.23±1.53μm,伤后30小时以上时水泡液no浓度为6.84±1.08μm,发现在伤后10至20小时时水泡液no浓度最高。2、烧伤创面中no浓度的测定:组织块碾磨后用同体积去离子水混合离心取上清。检测no浓度方法:采用与griessreagent同体积混合,酶标仪测量od450值,通过标准亚硝酸盐浓度标准曲线得出no浓度。结果发现:正常组织中no浓度为0.32±0.13μm,浅二度创面组织中no浓度为4.70±0.70μm。表明烧伤后创面组织中no浓度较正常组织中no浓度高出约15倍。3、深二度烧伤创面组织中inos的表达:烧伤患者正常组织及浅二度组织经石蜡包埋、切片后行免疫荧光组织化学发现,正常组织中inos表达不明显,而创面组织中在表皮的基底层及真皮组织中inos明显,其中表皮基底层inos的表达与表皮干细胞表面标志物角质蛋白ck19存在共定位。表明,烧伤后表皮干细胞中高表达inos。4、深二度烧伤创面组织及正常组织中inos蛋白的表达:烧伤患者正常组织及浅二度组织经组织蛋白性蛋白印迹检测发现,创面组织中no浓度较正常组织中no浓度高出14.8倍,表明烧伤后表皮组织高表达inos。二、原代人表皮干细胞的分离、培养及鉴定:主要是进行表皮干细胞的分离培养及细胞免疫化学、克隆实验和流式等鉴定手段,我们发现:Ⅳ型胶原10min快速黏附法可以快捷、方便的实现表皮干细胞分离富集,能较好的维持表皮干细胞的干性。1、原代人表皮干细胞的分离培养:采用Ⅳ型胶原快速粘附法结合无血清角质细胞培养基分离培养的细胞符合表皮干细胞的形态及"铺路石"样克隆生长;采用tripleselect细胞消化液消化细胞能快速消化细胞且能较好保持细胞的活性。2、细胞免疫荧光染色检测细胞中integrinβ1和ck19的表达:所培养的第二代细胞中表皮干细胞标志物keratin19和integrinβ1均呈强阳性表达。3、流式细胞仪检测分离培养细胞α6-integrin及cd71的表达:采用流式细胞分析技术发现第二代培养细胞中α6bricd71dim原代培养表皮细胞率为94.3±4.36%。4、细胞克隆形成能力检测:所培养第二代细胞具有较强的克隆形成能力,克隆形成率为33.1±4.8%。三、no对表皮干细胞迁移的影响及机制研究:（一）no对培养表皮干细胞迁移的影响:我们首先进行了no供体snap不同作用时间产生no浓度和snap对表皮干细胞的毒性检测;通过划痕实验和活性工作站完成no对表皮干细胞迁移和运动速度的检测,以及通过细胞骨架实验和pulldown技术检测no促进表皮干细胞迁移可能的物质基础。1、no供体snap产生no浓度的检测:我们通过传统no检测方法griess法测定snap加入细胞培养基后产生no情况,实验发现100μmsnap时在0、2、6、12、18、24、30、36、48小时时生成no的浓度分别为0.173、0.655、1.713、3.553、5.124、6.2818455、6.557、6.878、7.324μm;500μmsnap时在0、2、6、12、18、24、30、36、48小时时生成no的浓度分别为0.209、1.206、2.938、6.349、8.576、11.284、12.448、13.601、14.532μm。表明0-500μmsnap在细胞培养基中生成no浓度与snap浓度成正相关、与持续时间呈正相关。2、snap对表皮干细胞安全有效作用浓度测定:采用cck-8检测相对活细胞数量,结果snap浓度在0-500μm内通过cck-8测量的escs细胞数无显着差异（p>0.05）,而snap浓度在1000-4000μm时活细胞数量较对照组显着减少,snap1000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为52.12±5.96%;snap2000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为6.79±1.16%;snap4000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为5.62±1.63%。表明no供体snap的有效安全作用浓度为0-500μm。3、划痕实验检测no对escs迁移功能的影响:结果发现,随着snap浓度的升高（0100μmol/l）,划痕后不同时间点细胞迁移率较对照组均增加;其中划痕后12、24h,10、100μmol/lsnap组的迁移率较对照组有显着差异（p值均小于0.01）;而300、500μmol/lsnap组的迁移率较对照组减少,其中在划痕后18、24小时时有显着差异（p值均小于0.05）。其中划痕12小时时与对照组迁移率（48.8±2.7%）相比,100μmol/lsnap组迁移率达到了82.1±15.8%（p<0.01）,而500μmol/lsnap抑制的细胞迁移率为8.2±7.2%。实验表明低浓度的no供体snap（0-100μmol/l）时对细胞具有促进迁移的作用。4、活细胞工作站检测no对escs运动速度的影响:为进一步检测no对表皮干细胞运动功能的影响,我们通过活性工作站从细胞运动速度方面测定no对表皮干细胞运动速度的影响。研究发现,snap浓度在0100μmol/l时细胞运动速度逐步提高,100μmol/lsnap组的细胞运动速度为1.07±0.18μm/min,与其他组比较细胞运动速度最快。表明,低浓度的no供体snap（0-100μmol/l）时对细胞具有促进细胞运动的作用,而当snap高浓度时对细胞运动的抑制作用显着。5、激光共聚焦检测no对escs细胞骨架蛋白f-actin聚合作用:细胞骨架是细胞迁移与运动的基础,其中细胞骨架蛋白中最重要的是f-actin蛋白,f-actin蛋白的重组与细胞迁移具有直接关系。我们通过鬼笔环肽染色、激光共聚焦研究发现,结果发现:100μmno供体snap组huescs应力纤维f-actin纤毛明显增多,胞内应力性纤维束增粗,而阴性对照组纤毛稀少,胞内应力性纤维束纤细;经细胞骨架f-actin荧光染色强弱分析得出实验组较对照组应力性纤维增加了31.7%,具有显着性差异p=0.001。实验表明,no促进huescs应力纤维f-actin的聚合。6、pull-down技术检测no活化rhogtpase的作用:rhogtp酶是真核细胞中重要的信号转导分子,通过肌动蛋白和肌球蛋白对细胞骨架进行调控进而调控细胞运动,对肌动蛋白细胞骨架的调节起着主要作用。为此,我们通过pulldown技术检测发现,rhoa活化作用中snap组是对照组的4.14±0.33倍;rac1活化作用中snap组是对照组的1.78±0.07倍;cdc42活化作用中snap组是对照组的1.22±0.17倍。实验表明,100μmno供体snap组对rhoa、rac1具有显着的活化作用,而对cdc42的活化作用不明显。（二）no对培养表皮干细胞迁移的机制研究:cgmp-pkg是no最重要的下游信号转导途径,为此我们通过细胞划痕实验、细胞运动速度实验、细胞骨架实验、pull-down实验,分别分组给予cgmp抑制剂odq、pkg抑制剂rp-8pcpt-cgmps、rhoa抑制剂rhosin、cdc42抑制剂zcl278、rac1抑制剂z62954982及snap处理,此外还采用rhoa、rac1、cdc42的特异性小干扰rna验证“no通过cgmp-pkg调节活化rhogtpase,进而影响细胞骨架蛋白f-actin的聚合,最终促进escs迁移”的假说。1、划痕实验检测cgmppkgrhogtpase信号通路在no促进escs迁移中的作用:结果发现,对照组的细胞迁移率为74.25±5.59%;snap组的细胞迁移率为94.06±5.59%;odq+snap组的细胞迁移率为75.17±7.02%;rp-8pcpt-cgmps+snap组的细胞迁移率为70.91±10.09%;rhosin+snap组的细胞迁移率为71.39±9.74%;z62954982+snap组的细胞迁移率为76.28±7.26%;zcl278+snap组的细胞迁移率为86.58±4.89%;snap和cgmp、pkg的激动剂显着促进escs细胞的迁移,迁移率与对照组相比分别增加了9.78%和11.12%。结果表明,snap对escs细胞的迁移作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制剂阻断,其中rhoa抑制剂的抑制作用最显着,而cdc42抑制剂的阻断作用不明显。2、活细胞工作站实验检测cgmppkgrhogtpase信号通路在no促进escs运动速度的作用:结果发现,对照组的细胞运动速度为0.72±0.08μm/min;snap组的细胞运动速度为0.93±0.14μm/min;odq+snap组的细胞运动速度为0.78±0.06μm/min;rp-8pcpt-cgmps+snap组的细胞运动速度为0.74±0.07μm/min;rhosin+snap组的细胞运动速度为0.73±0.07μm/min;z62954982+snap组的细胞运动速度为0.72±0.06μm/min;zcl278+snap组的细胞运动速度为0.73±0.07μm/min。表明:no供体snap促进escs细胞的运动,其作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制剂阻断,其中rhoa抑制剂的抑制作用显着,而cdc42抑制剂阻断snap对escs运动速度的影响弱。3、激光共聚焦检测cgmppkgrhogtpase信号通路在no对escs细胞骨架蛋白f-actin聚合中的作用:我们采用imagej分析了皮层肌动蛋白（corticalactin）和丝状伪足（filopodia）观察细胞骨架蛋白f-actin的聚合情况。经统计分析发现皮层肌动蛋白对照组为103.33±3.41%,snap组为190.26±2.92%,odq+snap组为87.41±3.20%,rp-8pcpt-cgmps+snap组为104.33±1.75%,rhosin+snap组为80.12±2.21%;z62954982+snap组为120.83±3.61%,zcl278+snap组为141.68±4.75%。细胞的丝状伪足百分率对照组为25.00±3.86%,snap组为41.82±7.60%,odq+snap组为19.66±3.87%,rp-8pcpt-cgmps+snap组为25.27±7.57%,rhosin+snap组为24.00±6.29%,z62954982+snap组为31.87±3.49%,zcl278+snap组为31.14±11.69%。结果表明:得出no供体snap对esc细胞骨架蛋白f-actin具有聚合作用;cgmppkg以及rhogtpase的rhoa,rac1抑制剂均可阻断snap对escf-actin的聚合作用,而cdc42抑制剂的阻断作用不显着。4、pull-down技术检测cgmppkg在no活化rhogtpase中的作用:采用pull-down技术检测no供体snap处理表皮干细胞24小时对rhoa,cdc42和racl的活化。结果发现,对rhoa活化作用以对照组设为1,snap组为4.46±0.14;odq+snap组为0.89±0.11;rp-8pcpt-cgmps+snap组为1.52±0.12;对racl活化作用snap组为2.08±0.08,odq+snap组为0.72±0.12,rp-8pcpt-cgmps+snap组为1.22±0.17;对cdc42活化作用snap组为1.16±0.24,odq+snap组为1.21±0.13;rp-8pcpt-cgmps+snap组为0.89±0.13。表明no通过cgmp、pkg调节rhoa,rac1的活化作用。5、pull-down技术检测不同时间snap对活化rhoa的作用:采用pulldown技术检测snap在处理后6、12、18、24小时对rhoa,cdc42和racl的活化作用。结果发现,灰度值比较中对照组活化蛋白比总蛋白设为1（0小时）,6、12、18、24小时snap组对rhoa活化作用分别为3.38±0.56、4.09±0.46、3.60±0.39、4.17±0.43倍;而snap组对racl活化作用分别为2.55±0.48、2.69±0.75、2.56±0.47、2.69±0.44。表明在给予snap处理后escs中活化的rhogtpase持续高表达。6、sirna转染体外培养人表皮干细胞及sirna干扰效率检测:50nm的sirna采用脂质体2000转染表皮干细胞,以与rhogtpase无同源性的葡萄糖氧化酶glo的sirna作为阴性对照,为避免脱靶效应每一个mrna均采用两个不同的sirna。采用wb检测sirna的干扰效率均大于75%。同时我们采用rhoa、rac1和cdc42的特异性sirna干扰实验进一步验证了no通过rhogtpase的rhoa和rac1在no促进表皮干细胞迁移中的作用。7、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进escs迁移中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后进行划痕实验,结果发现,snap组的细胞迁移率为92.89±3.99%;siglo+snap组的细胞迁移率为90.68±4.22%;rhoasirna+snap组的细胞迁移率为53.25±5.78%、51.42±5.23%;rac1sirna+snap组的细胞迁移率为55.23±9.92%、61.06±8.43%;cdc42sirna+snap组的细胞迁移率为81.62±10.75%、80.29±13.04%。表明rhoasirna、rac1sirna可阻断snap对esc的迁移作用。表明,no通过rhogtpase的rhoa和rac1影响表皮干细胞的迁移作用。8、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进escs运动中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后进行活性工作检测细胞的运动速度实验,结果发现,siglo+snap组的细胞运动速度为0.96±0.07μm/min;rhoasirna+snap组的细胞运动速度为0.74±0.06μm/min、0.76±0.07μm/min;rac1sirna+snap组的细胞运动速度为0.83±0.05μm/min、0.83±0.03μm/min;cdc42sirna+snap组的细胞运动速度为0.90±0.10μm/min、0.93±0.09μm/min。表明rhoasirna、rac1sirna可阻断no对esc运动速度的促进作用。9、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进骨架蛋白f-actin聚合中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后给予no供体snap处理24小时。通过imagej分析了皮层肌动蛋白（corticalactin）和丝状伪足（filopodia）的表达观察细胞骨架蛋白f-actin的聚合与重排作用。研究表明,rhogtpase的rhoa、rac1的mrna干扰小rna可阻断snap对escs的f-actin的聚合作用。四、no对皮肤创面愈合及在体表皮干细胞迁移的影响:为进一步探讨no在创面愈合、上皮化以及进一步验证no对esc的在体迁移情况,我们在brdu在体标记表皮干细胞基础上采用全层皮肤缺损模型研究no在创面愈合、上皮化以及对esc迁移。应用brdu在体标记表皮干细胞后孔器器打孔,伤口大小为直径4.5mm,分组分别给予腹腔注射生理盐水组,甘氨酸（gly）,一氧化氮合成底物（l-精氨酸）及一氧化氮合酶抑制剂（l-nmma）。分别于伤后0、1、3、5、7、9天观察创面愈合情况,于第9天取材做he染色观察创面上皮化情况,于第12天观察esc迁移情况。1、no在创面愈合中的作用:我们采用全层皮肤缺损模型模型检测no对创面的愈合作用。结果发现,致创后第1、3、5、7、9天创面愈合率分析生理盐水组分别为20.08±3.03%,47.97±4.99%,70.00±3.49%,80.54±2.17%,70.95±3.56%;L-精氨酸组致分别为29.30±3.55%,47.97±4.99%,89.61±2.69%,94.74±2.43%,98.75±0.81%;L-NMMA组为18.91±3.06%,44.47±4.99%,64.58±4.52%,72.45±2.52%,76.72±3.84%。结果表明,创面缺损模型中NO合成底物L-精氨酸促进创面愈合;NO合成酶抑制剂L-NMMA创面愈合速度较对照组明显减慢。2、NO在创面上皮化中的作用:同上我们在致创后第9天创面组织取材,切片行H&E-染色并经统计分析结果。发现,生理盐水组未上皮化创面大小为1.44±0.32mm,未上皮化创面大小甘氨酸组为1.37±0.52mm、L-精氨酸组0.38±0.41mm、L-NMMA为2.54±0.61mm。实验表明,创面缺损模型中NO合成底物L-精氨酸促进创面上皮化,具有显着性差异;NO合成酶抑制剂L-NMMA与对照组比较明显抑制创面上皮化。3、BrdU标记ESC后全层皮肤缺损模型中NO对ESC迁移作用研究:Brd U在体标记表皮干细胞基础上,在全层皮肤缺损模型中给与NO处理,研究NO对ESC迁移情况。研究发现,在同一高倍视野再生表皮中BrdU阳性细胞对照组为12.27±2.67个,甘氨酸组为14.88±5.14个,L-精氨酸组为24.04±8.34个,L-NMMA组为6.67±2.42个。表明,L-精氨酸组创面上皮化中的BrdU阳性细胞较其他组显着增多,同时NO合成酶抑制剂L-NMMA组中BrdU阳性细胞较其他组少。总结:1、烧伤后表皮干细胞可能通过高表达i NOS,而促进烧伤创面NO的大量产生;2、Ⅳ型胶原快速黏附结合K-SFM角质细胞专用无血清培养基培养是一种简单、快捷、有效分离、纯化人表皮干细胞的方法;3、NO供体SNAP对体外培养人表皮干细胞的最佳作用浓度为100μM。4、NO通过cGMP/PKG调节Rho GTPase的Rho A和Rac1的活化影响细胞骨架蛋白F-actin的聚合,进而促使表皮干细胞迁移,最终促进创面愈合。5、在体实验中,NO可能通过促进表皮干细胞迁移,而促进创面再上皮化,最终促进皮肤创面愈合。综上所述,烧伤后创面表皮干细胞可能通过高表达i NOS,产生大量NO,产生的NO通过c GMP/PKG调节Rho GTPase中Rho A和Rac1的活化,继而增加细胞骨架F-actin蛋白的聚合,进而促使表皮干细胞迁移,最终促进创面愈合。
吴永胜[7]（2016）在《胎儿皮肤与成人皮肤的形态结构及表皮干细胞分子标记物的比较》文中进行了进一步梳理背景皮肤是人体面积最大的器官,承担着防御微生物入侵、免疫监控、调节感觉和体温等重要功能。出生后当皮肤遭受巨大的损伤如三度烧伤、大面积创伤时,通常难以完整修复和愈合,多数会导致瘢痕的形成。然而,过去的很多研究发现胎儿皮肤发育过程中的一种特殊现象,即当胎儿皮肤受损时,可以进行无瘢痕愈合。表皮干细胞位于皮肤基底层,具有自我更新,不断增殖和分化的特性。表皮干细胞的增殖分化是维持正常皮肤组织结构的基本条件。一方面,该细胞能维持皮肤自身的角化与更新；另一方面,它在皮肤损伤后的修复中起到关键作用。表皮干细胞在损伤修复中的功能已成为皮肤损伤修复的一个研究热门方向。胎儿皮肤和出生后机体皮肤的功能差异,我们猜测可能是由于表皮干细胞功能的差异导致的。因此,对比研究胎儿皮肤和成人皮肤形态结构及表皮干细胞分子标记物的差异,有助于发现无瘢痕修复的机制,进而为出生后机体皮肤损伤的修复和治疗,提供新的方法和思路,以期为后续的临床治疗提供一定的理论依据。目的探索胎儿皮肤与成人皮肤的形态结构及表皮干细胞分子标记物的差异,为后续的皮肤功能的研究及皮肤移植提供实验基础。方法分别取胎儿与成人背部皮肤。标本取材后立即用10%中性甲醛固定,石蜡包埋。所有标本经系列切片后,一组进行HE染色,比较其皮肤表皮、真皮和皮肤附属器的形态结构；另一组分别采用抗β1整合素、角蛋白19（K19）和p63单克隆抗体作为一抗,应用免疫组织化学法检测两组皮肤组织中表皮干细胞标志物的表达。结果成人与胎儿皮肤表皮、真皮和皮肤附属器结构不同。成人全层皮肤明显厚于胎儿皮肤,尤其是成人皮肤的真皮层明显较胎儿真皮发达,成人皮肤表皮和真皮乳头状突起明显,而胎儿皮肤乳头状突起不明显,相对平整。成人表皮由6-7层上皮细胞组成,而胎儿表皮由2-3层上皮细胞组成。成人基底层细胞呈立方形或柱形,细胞核染色较深,呈卵圆形,居中,胎儿基底层细胞呈立方形,细胞核圆形深染。成人皮肤有明显的颗粒层,但细胞轮廓不清晰,胞质内可见蓝色颗粒,而胎儿皮肤则未发现颗粒层细胞。经测定胎儿皮肤的P63、β1整合素和角蛋白19的MOD值分别为0.0291±0.0015,0.0955±0.0069,0.0632±0.0136和0.1406±0.0051、0.0085±0.0015、0.7304±0.0541,采用SPSS 13.0软件进行分析（P＜0.05）两者的分布在统计学上存在明显差异。结论成人和胎儿皮肤表皮、真皮和皮肤附属器形态结构存在较大差异,表皮干细胞的分子标记物表达也存在显着差异。
王艳波,王思农[8]（2014）在《表皮干细胞在烧伤创面修复中的作用研究进展》文中研究说明表皮干细胞具有无限增殖和分化的潜能,是皮肤及其附属器发生、修复、重塑的基础。近年来,表皮干细胞的研究已引起国内外越来越多的关注。本文从干细胞,表皮干细胞的概念、特征、来源、分布及在烧伤创伤修复中表皮干细胞的分布特征等方面探讨表皮干细胞在创面修复中的作用研究进展。
张坤[9]（2014）在《复方黄柏液对大鼠感染性创面表皮干细胞表达的影响及干预机制研究》文中研究表明目的：通过观察中药复方黄柏液对肛瘘术后患者创面的治疗效果及对大鼠感染性创面模型创面组织表皮干细胞（ESCs）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）、β-连环素（β-catenin）、基质细胞衍生因子（SDF-1α）等的调控作用，从表皮干细胞、炎症介质和细胞因子的角度，探讨感染性创面迟缓愈合的病理机制及复方黄柏液促感染性创面愈合的机理。方法：（1）临床研究：60例低位肛瘘术后病人在常规治疗的基础上应用复方黄柏液治疗，与对照组对比，观察创面愈合率、愈合时间、创面肉芽情况、疼痛程度等情况。（2）实验研究：选取Wistar大鼠制成全层皮肤缺损模型，创面接种细菌形成感染性创面，分别观察正常组、模型组、中药组、西药组的创面愈合情况，并检测创面组织病理改变及β1-integrin、k19、TNF-α、IL-6、β-catenin、SDF-1α的表达变化。结果：临床研究证实，复方黄柏液较对照组能明显缩短创面愈合时间，提高创面愈合率，且能减轻患者术后的疼痛。动物实验提示模型组创面组织TNF-α、IL-6水平显着高于正常组，表皮干细胞标志物表达弱于正常组，复方黄柏液能降低TNF-α、IL-6的水平，改善炎症环境，提高β-catenin、SDF-1α的表达水平，增强表皮干细胞标志物的表达。结论：感染性创面愈合迟缓与TNF-α、IL-6过度表达抑制了表皮干细胞的增殖有关；复方黄柏液促进感染性创面的愈合，其作用机制之一可能通过降低TNF-α、IL-6的水平，改善创面病理性炎症状态，进而激活表皮干细胞增殖分化关键因子β-catenin、增强细胞趋化因子SDF-1α的表达水平，从而促进表皮干细胞的增殖、迁移。
徐苗苗[10]（2014）在《大鼠表皮干细胞体外培养和α-MSH及MC1R表达研究》文中研究说明研究背景：表皮干细胞（EpSCs，Epidermal stem cells）自发现以来一直是研究的热点，作为皮肤组织的特异性干细胞，具有高度的自我更新能力及多向分化潜能，其不仅维持皮肤日常的新陈代谢及皮肤内环境稳态，而且与创面修复紧密相连。当受到外界损伤刺激时，EpSCs可主动参与损伤皮肤的修复，通过脱粘附、迁移、增殖，并向表皮终末细胞分化，诱导表皮角质形成细胞向创面爬行，进而覆盖创面，促进再上皮化，最终达到修复创面的目的。α-促黑素（α-MSH，α-melanocyte stimulating hormone）最初被人们发现是因其在促进黑素生成、调节皮肤色素沉着方面的作用。近年来大量研究证实，α-MSH在抗炎、退热、抗菌、营养神经、能量平衡、调节心血管功能、影响动物生物学行为及维持免疫功能相对稳定等方面都发挥了重要的调控作用。α-MSH通过与黑皮素受体（melanocortin receptor，MCR）结合发挥其生理功能。MCR是一个G蛋白偶联型受体，至今已有5种MCR被克隆和定性，皮肤中发现的主要是MC1R（Melanocortin1receptor，MC1R）、MC2R（Melanocortin2receptor，MC2R）及MC5R（Melanocortin5receptor，MC5R）。已发现MC1R在黑素细胞、角质形成细胞、皮脂腺细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞、真皮免疫细胞和内皮细胞等几乎所有类型的皮肤组织细胞中均有表达，且与这些细胞的关系最为密切。本实验从大鼠皮肤基底层分离培养出EpSCs，并进行鉴定；同时检测EpSCs中α-MSH及其受体MC1R的表达情况，为研究α-MSH对EpSCs的调控作用等后续实验打下基础，以便进一步丰富完善创面修复的基础理论和临床应用。方法：1．实验以新生SD大鼠背部皮肤为材料，采用“胰酶两步消化+IV型胶原差速贴壁法”分离纯化原代大鼠EpSCs，无血清低钙培养基为其提供营养。2．采用免疫化学技术：细胞免疫荧光（Immunofluorescence，IF）、蛋白印记法（Western Blotting，WB）、流式细胞术（Flow Cytometric，FCM）检测EpSCs表面标记物β1-整合素、α6-整合素、角蛋白19（Cytokeratin19，K19）及CD71的表达情况，确定其是否符合EpSCs标准。3．通过IF单染和双染法检测大鼠EpSCs中α-MSH及其受体MC1R的表达情况，并采用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chainReaction，RT-PCR）检测受体MC1R的表达情况。结果：1．倒置相差显微镜下观察，细胞培养2-3天，即有小克隆形成，并呈不规则椭圆形；培养4-5天，细胞增殖明显加快，克隆变大；培养7-8天，细胞融合至70-80%，形成铺路石状，折光性好。2．检测大鼠EpSCs的表面标记物发现：WB检测培养的细胞表达β1-整合素；共聚焦显微镜下观察，细胞可同时表达K19和β1；FCM检测结果显示，2代EpSCs高表达α6，低表达CD71。3．IF检测到EpSCs表达α-MSH；免疫荧光双标法发现，K19与MC1R、α6与MC1R表达均呈阳性；RT-PCR显示体外培养的EpSCs表达受体MC1R及α-MSH的前体及合成酶。结论：“胰酶两步消化+IV型胶原差速贴壁法”可获得形态均一、活力好、纯度较高的大鼠EpSCs；体外培养的大鼠表皮干细胞表达α-MSH及受体MC1R。
二、不同发育阶段人皮肤β1整和素及细胞角蛋白K19表达特征及其与创面修复结局关系的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同发育阶段人皮肤β1整和素及细胞角蛋白K19表达特征及其与创面修复结局关系的研究（论文提纲范文）
（1）小鼠皮肤损伤后表皮干细胞标志物表达的时间相关性研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 皮肤创面修复中表皮干细胞标志物表达的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）角膜缘干细胞标志物及其干性相关通路的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 角膜上皮的动态稳定 |
| 1.1.1 角膜的组织学结构和功能 |
| 1.1.2 X/Y/Z假说 |
| 1.2 LSCs及其niche |
| 1.2.1 LSCs的生物学特征 |
| 1.2.2 LSC niche的结构 |
| 1.2.3 LSCs niche的组成 |
| 1.3 LSCs标志物研究现状 |
| 1.3.1 细胞周期调控蛋白 |
| 1.3.2 ATP结合转运蛋白 |
| 1.3.3 细胞骨架蛋白 |
| 1.3.4 分化相关蛋白 |
| 1.4 LSCs的识别 |
| 1.4.1 LSCs标记物共表达 |
| 1.4.2 细胞核质比大于0.7(N/C≥0.7) |
| 1.4.3 标签滞留 |
| 1.4.4 侧群现象 |
| 1.5 LSCs特异性标志物研究的难点 |
| 1.5.1 角膜缘组织学的特殊性 |
| 1.5.2 酶消化的影响 |
| 1.5.3 缺乏理想的LSCs分离技术 |
| 1.5.4 LSCs的时间和空间分布的影响 |
| 1.6 新一代测序技术应用于LSCs标志物的研究 |
| 1.6.1 转录组测序在LSCs标志物的研究 |
| 1.6.2 蛋白质组测序在LSCs标志物的研究 |
| 1.7 本课题的来源与研究意义 |
| 1.8 本课题的研究思路及主要研究内容 |
| 第2章 小鼠角膜缘干细胞表达特点的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织收集 |
| 2.2.2 石蜡切片制备 |
| 2.2.3 HE染色 |
| 2.2.4 免疫组化染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠眼球角膜的组织学结构 |
| 2.3.2 LSCs标志物在小鼠眼球表面的空间表达分布 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.4.1 小鼠LSCs具有独特的niche结构 |
| 2.4.2 4周龄小鼠LSCs的表达模式不同 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 小鼠角膜缘干细胞的基因表达与发育相关性的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 组织收集 |
| 3.2.2 蜡切片制备 |
| 3.2.3 HE染色 |
| 3.2.4 免疫组化染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠眼角膜的发育 |
| 3.3.2 小鼠LSCs标志物的表达与发育相关 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.4.1 光刺激促进小鼠角膜上皮的发育 |
| 3.4.2 LSCs的表达具有时间特性 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 基于Illumina平台的小鼠角膜缘干细胞干性相关基因的转录组学研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂和耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 组织收集 |
| 4.2.2 总RNA提取 |
| 4.2.3 文库制备以及Illumina Hiseq Xten测序 |
| 4.2.4 转录组学序列的分析 |
| 4.2.5 基因的表达以及功能分析 |
| 4.2.6 qRT-PCR |
| 4.2.7 免疫组化染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 转录组学测序概述 |
| 4.3.2 样品间基因表达相关性 |
| 4.3.3 DEGs的识别 |
| 4.3.4 DEGs的 GO分析 |
| 4.3.5 DEGs的 KEGG通路富集 |
| 4.3.6 DEGs的 qRT-PCR验证 |
| 4.3.7 细胞表面标志物的免疫组化染色 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.4.1 潜在的LSCs标志物表达的模式 |
| 4.4.2 在LSCs中富集到的与发育和细胞命运相关的GO条目 |
| 4.4.3 ECM相关的信号通路维持LSCs的表型 |
| 4.4.4 LSCs的基因表达模式与细胞间交流有关 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 基于Label-Free LC-MS/MS的小鼠的角膜缘干细胞标志物的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂和耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 组织收集 |
| 5.2.2 总蛋白提取和肽段酶解 |
| 5.2.3 质谱分析和LC-MS/MS数据采集 |
| 5.2.4 DEPs的生物信息学分析 |
| 5.2.5 免疫印迹检测(WB) |
| 5.2.6 免疫组化染色 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 质量控制以及鉴定蛋白质和肽段的特性 |
| 5.3.2 DEPs的识别 |
| 5.3.3 DEPs的 GO分析 |
| 5.3.4 DEPs的 KEGG通路富集 |
| 5.3.5 免疫组化染色检测候选LSCs标志物 |
| 5.3.6 DEPs的验证 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2 可作为候选LSCs标志物 |
| 5.4.2 细胞粘附蛋白维持LSCs表型及其niche细胞间的联系 |
| 5.4.3 Focal粘附信号通路调控LSCs增殖和自我更新 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 联合转录组学和蛋白质组学分析小鼠角膜缘干细胞干性相关通路 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 技术路线 |
| 6.2.2 关联数量及其表达量相关性统计分析 |
| 6.2.3 表达趋势相同的DEGs和 DEPs的生物信息学分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 关联数量统计 |
| 6.3.2 表达量相关性分析 |
| 6.3.3 关联到的表达趋势一致的DEPs的蛋白互作网络分析 |
| 6.3.4 关联到的表达趋势一致的DEPs的GO分析 |
| 6.3.5 关联到的表达趋势一致的DEPs的KEGG分析 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.4.1 细胞外外泌体参与CECs-LSCs的交流 |
| 6.4.2 Focal粘附、ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路维持LSCs干性表型 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）黄芪注射液介导Wnt/β-Catenin信号通路调控表皮干细胞增殖分化促进糖尿病溃疡愈合的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 动物饲养 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物糖尿病模型建立 |
| 1.2.2 动物糖尿病溃疡模型建立及分组 |
| 1.2.3 动物分组给药 |
| 1.2.4 动物取材 |
| 1.2.5 组织病理学 |
| 1.2.6 免疫组织化学方法 |
| 1.2.7 免疫组织图像分析法 |
| 1.2.8 Western Blot |
| 1.2.9 Real Time-qPCR |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 建立大鼠糖尿病模型及皮肤溃疡模型 |
| 2.2 大鼠一般情况变化 |
| 2.3 各组大鼠体重、血糖变化情况 |
| 2.3.1 各组大鼠体重变化情况 |
| 2.3.2 大鼠血糖变化情况 |
| 2.4 各组大鼠创面愈合率、愈合时间比较 |
| 2.4.1 创面愈合率比较 |
| 2.4.2 创面愈合时间比较 |
| 2.5 各组大鼠创面愈合情况 |
| 2.6 创面组织HE染色 |
| 2.7 创面组织免疫组化检测 |
| 2.7.1 各组大鼠创面组织K19表达的比较 |
| 2.7.2 各组大鼠创面组织β1整合素表达的比较 |
| 2.7.3 各组大鼠创面组织PCNA表达的比较 |
| 2.8 创面组织Western Blot检测 |
| 2.8.1 各组大鼠不同时间点创面组织β-Catenin蛋白的表达 |
| 2.8.2 各组大鼠不同时间点创面组织GSK3β蛋白的表达 |
| 2.8.3 各组大鼠不同时间点创面组织β-Catenin核内表达情况 |
| 2.8.4 各组大鼠不同时间点创面组织C-myc、Cyclin D1的表达 |
| 2.9 创面组织Real Time-qPCR检测 |
| 2.9.1 各组大鼠不同时间点创面组织β-Catenin、GSK3βmRNA的表达 |
| 2.9.2 各组大鼠不同时间点创面组织Wnt1、wnt3am RNA的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中医学对糖尿病溃疡的认识 |
| 3.1.1 病因病机 |
| 3.1.2 治疗方法 |
| 3.2 西医学对糖尿病溃疡创面修复的认识 |
| 3.3 Wnt通路、表皮干细胞增殖分化与糖尿病溃疡的相关性 |
| 3.4 人重组表皮生长因子促进糖尿病溃疡愈合的作用 |
| 3.5 黄芪促进糖尿病溃疡愈合的中医理论基础与作用机制 |
| 3.5.1 黄芪促进糖尿病溃疡愈合的中医理论基础 |
| 3.5.2 黄芪促进创面愈合的作用机制 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、文献综述(全文) 中医药促进糖尿病溃疡愈合机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 二、在校期间参加学术会议及参与课题 |
（4）外源性免疫细胞及神经毒素在人胚胎皮肤及正常成人皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤创面愈合过程中的作用观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人化裸鼠模型的构建及不同阶段人类皮肤生长发育的动态观察 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 深Ⅱ°烧(烫)伤修复模型的构建以及烫伤后创面修复过程的变化观察 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 外源性成熟免疫细胞的注射干预及其对深Ⅱ°烧(烫)伤创面愈合的影响观察 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 外源性神经毒素的注射干预及其对深Ⅱ°烧(烫)伤创面愈合的影响观察 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附:外文论文 |
（5）CD271联合TrkA受体通过促进表皮干细胞的增殖和迁移促进创面愈合的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 实验结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（6）烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 烧伤后创面一氧化氮的产生 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 原代人表皮干细胞分离、培养及鉴定 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 NO对培养表皮干细胞迁移的影响及机制研究 |
| 第一节 NO对培养表皮干细胞迁移的影响 |
| 3.1.1 实验材料和方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 小结 |
| 第二节 NO促进培养人表皮干细胞迁移的机制研究 |
| 3.2.1 实验材料和方法 |
| 3.2.2 实验结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.2.4 小结 |
| 第四部分 NO对皮肤创面愈合及在体表皮干细胞迁移的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 表皮干细胞及其在创面修复中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）胎儿皮肤与成人皮肤的形态结构及表皮干细胞分子标记物的比较（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物及标本 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 常用实验试剂 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 1.5 石蜡切片制作 |
| 1.6 HE染色 |
| 1.7 免疫组织化学染色 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HE染色 |
| 2.2 免疫组织化学染色 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）表皮干细胞在烧伤创面修复中的作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 表皮干细胞 |
| 1.1 定义 |
| 1.2 特征 |
| 1.3 来源 |
| 1.4 位置与分布 |
| 2 表皮干细胞与烧伤创面修复 |
| 2.1 表皮干细胞在不同深度烧伤创面的分布 |
| 2.2 表皮干细胞在烧伤创面修复过程中的分布 |
| 2.3 影响表皮干细胞在烧伤创面分布的因素 |
| 2.4 表皮干细胞在临床的应用 |
| 3 小结 |
（9）复方黄柏液对大鼠感染性创面表皮干细胞表达的影响及干预机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 感染性创面中医研究概况 |
| 一、感染性创面的概念 |
| 二、感染性创面病因病机研究 |
| （一）瘀毒的含义 |
| （二）瘀毒理论在感染性创面修复中意义 |
| 三、感染性创面治则治法研究 |
| （一）古代医家对感染性创面的治疗 |
| （二）感染性创面治疗现状 |
| 四、本研究涉及方药特点分析 |
| （一）中药功效溯源 |
| （二）配伍特点 |
| （三）用法特点 |
| 五、小结 |
| 第二部分 临床研究 |
| 一、研究对象与方法 |
| （一）病例选择 |
| （二）一般资料 |
| （三）诊断标准 |
| （四）纳入标准 |
| （五）排除标准 |
| （六）剔除标准 |
| （七）病例分组 |
| （八）治疗方法 |
| （九）观察指标及方法 |
| （十）统计学方法 |
| 二、研究结果 |
| （一）两组患者创面痊愈时间比较 |
| （二）术后两组创面愈合率比较 |
| （三）术后两组创面肉芽生长积分情况比较 |
| （四）术后两组疼痛积分情况 |
| （五）治疗三周后临床疗效比较 |
| （六）安全性评价 |
| 三、讨论 |
| （一）肛瘘的治疗概况 |
| （二）肛瘘术后病机特点 |
| （三）肛瘘术后治法概要 |
| （四）复方黄柏液临床疗效分析 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 复方黄柏液对大鼠感染性创面愈合的影响 |
| 一、实验材料 |
| （一）实验动物 |
| （二）实验药物 |
| （三）主要试剂 |
| （四）实验器材 |
| 二、实验方法 |
| （一）造模方法 |
| （二）动物分组 |
| （三）给药方法 |
| （四）观察指标 |
| （五）统计方法 |
| 三、实验结果 |
| （一）创面愈合率 |
| （二）创面愈合时间 |
| 实验二 复方黄柏液对感染性创面创缘皮肤β1-integrin、k19 表达的影响 |
| 一、实验材料 |
| （一）实验动物 |
| （二）实验主要仪器 |
| （三）实验试剂 |
| （四）实验药物 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| （一）HE 染色结果 |
| （二）免疫组织化学染色结果 |
| 实验三 复方黄柏液对创面 TNF-α、IL6、β-catenin、SDF-1α蛋白表达的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 实验四 复方黄柏液对创面 TNF-α mRNA、IL6 mRNA、β-catenin mRNA、SDF-1α mRNA 表达的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 一、感染对创面修复的影响 |
| 二、炎症细胞因子与感染性创面的修复 |
| 三、炎症环境与表皮干细胞表达的相关性探讨 |
| （一）感染性创面表皮干细胞的表达 |
| （二）炎症对表皮干细胞微环境的影响 |
| 四、本研究涉及的动物模型及实验药物 |
| （一）大鼠感染性创面模型的建立 |
| （二）实验药物的选择及意义 |
| 五、复方黄柏液对感染性创面表皮干细胞表达的影响及干预机制 |
| （一）复方黄柏液对感染性创面表皮干细胞表达的影响 |
| （二）复方黄柏液干预机制探讨 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 详细摘要 |
（10）大鼠表皮干细胞体外培养和α-MSH及MC1R表达研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠表皮干细胞的分离、培养与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大鼠表皮干细胞中α-MSH及MC1R的检测 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、不同发育阶段人皮肤β1整和素及细胞角蛋白K19表达特征及其与创面修复结局关系的研究（论文参考文献）
- [1]小鼠皮肤损伤后表皮干细胞标志物表达的时间相关性研究[D]. 吴涛. 重庆医科大学, 2020(01)
- [2]角膜缘干细胞标志物及其干性相关通路的研究[D]. 郭志侯. 华侨大学, 2019(01)
- [3]黄芪注射液介导Wnt/β-Catenin信号通路调控表皮干细胞增殖分化促进糖尿病溃疡愈合的机制研究[D]. 仇莲胤. 上海中医药大学, 2019(03)
- [4]外源性免疫细胞及神经毒素在人胚胎皮肤及正常成人皮肤深Ⅱ°烧（烫）伤创面愈合过程中的作用观察[D]. 张基勋. 山东大学, 2019(09)
- [5]CD271联合TrkA受体通过促进表皮干细胞的增殖和迁移促进创面愈合的初步研究[D]. 张敏. 山东大学, 2018(02)
- [6]烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究[D]. 詹日兴. 第三军医大学, 2016(02)
- [7]胎儿皮肤与成人皮肤的形态结构及表皮干细胞分子标记物的比较[D]. 吴永胜. 安徽医科大学, 2016(01)
- [8]表皮干细胞在烧伤创面修复中的作用研究进展[J]. 王艳波,王思农. 社区医学杂志, 2014(20)
- [9]复方黄柏液对大鼠感染性创面表皮干细胞表达的影响及干预机制研究[D]. 张坤. 山东中医药大学, 2014(03)
- [10]大鼠表皮干细胞体外培养和α-MSH及MC1R表达研究[D]. 徐苗苗. 南华大学, 2014(02)